液相色谱常见问题的解决方法.docVIP

液相色谱常见问题的解决方法 ??一.保留时间不稳定1.柱温变化?柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡?至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够?用25mmol/L的缓冲液4.柱污染?每天冲洗柱5.柱内条件变化?稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命?采用保护柱?二.保留时间缩短1.流速增加?检查泵,重新设定流速2.样品超载?降低样品量3.键合相流失?流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化?防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加?柱恒温 三.保留时间延长1.流速下降?管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化?用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失?同前(二)34.流动相组成变化?同前(二)45.温度降低?同前(二)5四.出现肩峰或分叉?1.样品体积过大?用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强?采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道?更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效?更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏?更换进样器转子 五.鬼峰?1.进样阀残余峰?每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物?处理样品3.柱未平衡?重新平衡柱,用流动相作样品溶剂?(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)?每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)?通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 六.基线噪声?1.气泡(尖锐峰)?流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)?清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声?更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)?采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡?流动相脱气,加柱后背压七.峰拖尾?1.柱超载?降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰?清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用?加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4?同前(四)45.同前(四)3?同前(四)36.死体积或柱外体积过大?连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能?采用细内径的连接管7.柱效下降?用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 八.峰展宽?1.进样体积过大?同(四)12.在进样阀中造成峰扩展?进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢?设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大?设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高?增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大?用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长?等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大?将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载?进小浓度小体积样品 色谱柱预防性保护与柱寿命的延长 ??通常，一根色谱柱在分析数千个样品之后性能仍然保持良好，但也有的柱仅分析不多的样品后几乎就报废了。影响柱寿命和其它问题的因素很多，而有些因素是操作者很难控制的，如果被分析的样品（如分析生物样品），怎么净化样品也是“脏”的，好于色谱柱的影响是非常大的。然而采取下列措施后，在多数情况下总能够人为地减少柱上故障，达到延长柱寿命的目的。?1．加流路过滤器和保护柱?流路过滤器紧靠进样阀后面，位于分析柱前。0.5μm烧结不锈钢片夹在死体积很小的套子中，挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒入柱。因为每个样品都过滤既费事又带来误差，样品量少过滤更困难，因此流路上装过滤器是比较省事的办法。也可以在流路加上保护柱，放在流路过滤器和分析柱之间，或者代替流路过滤器。保护柱的使命是收集阻塞柱进口的来自样品的化学“垃圾”。这程垃圾最终隐藏低柱效能。保护柱应该是小体积，用分析柱的同种填料填装。保护柱使用得当，对分离无影响，好像未装保护柱一样。有些厂商的商品将保护柱都是用短柱、不超过3cm长，内径2～3mm，用较大粒度的填粒（15～20μm）干法填装，会使分析柱的效能有所降低。? 2．避免高压冲击?一般色谱柱都能经得起高压，但经不起突然变化的高压冲击。引起高压突然冲击，主要是因样品阀的缓慢转动、泵起动快，柱切换操作等。等面已讨论过，转动六通进样阀时从泵到柱的液流会瞬时切断。在阀的泵侧压力升高，在阀的柱侧压力降低（变化超过20%）。阀转到底后压力突然冲击一下恢复正常，手动进样阀的变化不大，自动进样阀比较慢，可能造成压力冲击，可用氦气代替空气驱动进样阀。因氨压缩系数小。另外泵起动不应过快，可分步操作。如用3ml/min流速，先从1mL/min到2mL/min，然后再3ml/min，每个间隔应大于20s。?柱切换技术的应用也很广泛，切换过程中在色谱柱的入口处压