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柚苷酶应用下食品工业论文(共5106字) 1柚苷酶酶活测定方法 1.1Davis紫外分光光度计法 现在多采用改良后的Davis测酶活方法，该种方法也是测定酶活应用最多的一种。但缺点是后期紫外分光光度计时会受到底物颜色的限制，柚皮苷为黄色溶液，可能影响柚皮苷含量的测定，进而使测定的酶活不准确，并且仅是对底物柚皮苷的含量测定来获得柚苷酶的酶活力大小，无法知道组成该酶的其他酶α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶活力情况。 1.2高效液相色谱仪测定柚皮苷含量 用高效液相色谱来测定柚苷酶水解的底物柚皮苷的含量，不仅可以测定柚苷酶的酶活力，同时还可以测得α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶活力大小，使酶活测定精确具体化，检测柚皮苷的精确度高，误差小，提高了结果的准确性，但是操作较前一种Davis法繁琐，时间延长。对于不同的柚苷酶，高效液相色谱法检测分析的实验条件不同。陈月龙在其论文中采用高效液相色谱测定酶活时的流动相选取的是甲醇、水、乙腈并采用不同梯度洗脱分离柚苷酶水解后的产物，从其结果中可看出实现了柚皮苷、柚皮素与普鲁宁的完全分离。邓媛等也采用高效液相色谱对柚苷酶活力以及普鲁宁酶活力进行测定，同时进行了酶促动力学研究，得出柚苷酶酶解的最佳条件。高效液相色谱法测定柚皮苷含量的优点是直接反映酶解作用的各种产物含量，可获得该酶所包含的各种酶的酶活力大小，方法准确直观，直接测得不同酶活力大小，缺点是操作较复杂。 2微生物来源柚苷酶的制备 2.1柚苷酶产生菌株的筛选 有效的微生物筛选方法可以大量节约菌株筛选的时间和成本，因此在筛选柚苷酶产生微生物的过程中选择合适的筛选方法至关重要。目前微生物的筛选方法有透明圈法、高层试管法以及定性滤纸显色法，其中高层试管法和定性滤纸法误差较大，相较而言，透明圈法操作简单，观察方便，适用于定性筛选，是目前应用较为广泛的一种筛选微生物方法。 2.1.1透明圈法透明圈法是指微生物分解平板培养基中溶解性较差的底物，使菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。卢建明等人研究发现将菌悬液涂布于长有菌落的培养基内，能分解柚皮苷产柚苷酶的菌落在四周就会出现一圈肉眼可见的透明圈，但是该种方法存在误差并不能有效判断菌株产柚苷酶状况。陈玲等改良了柚苷酶平板透明圈筛选模型，利用硫酸二乙酯（DES）能与培养基中未分解的底物柚苷发生黄色反应这一原理，加入一定比例的硫酸二乙酯（DES）混合液，反应后菌落周围出现了肉眼清晰可见的透明圈。这种方法加大了透明层与外围未分解培养基的颜色对比，便于观察和测量透明圈的大小，简化了检测步骤，提高了菌种筛选效率，是目前应用最为广泛的一种柚苷酶产生菌株的筛选方法。 2.1.2高层试管法高层试管法的原理是通过菌体在试管培养基中产酶并逐渐扩散开，分解培养基中所含柚皮苷产生的透明层来判断菌株的产酶能力大小，但是此方法也不易观察区分开透明层的界限使判断有误差。3.1.3定性滤纸显色法定性滤纸显色法是利用柚皮苷水解后不显色来区分产不产生柚苷酶分解柚皮苷，柚皮苷在培养基中既作为产酶的诱导物，又作为酶的底物在显色时作指示剂，一次性加入简化了分析的操作步骤。但是文献中采用较少，目前应用最多的仍为透明圈法，有待开发出新的高效筛选产柚苷酶微生物的方法。 2.2柚苷酶产生菌株的改良 通过传统筛选方法从自然环境中筛选的野生菌株的产酶能力一般不高，且筛选方法工作量大，效率低。因此有必要运用现代生物技术（如原生质体诱变育种、基因工程育种等）对天然菌株进行改良获得柚苷酶高产菌株，以便得到适合工业化生产的菌株，使得在工业生产中广泛应用。其中原生质体诱变育种包括物理诱变与化学诱变。 2.2.1物理诱变物理诱变育种技术目前已成为工业上微生物育种中最为常用和最有效的技术之一，对微生物诱变效果比较好而且应用广泛的主要有紫外线、x射线、射线和快中子等。以上诱变技术所用的设备简单、操作方便，利用这些诱变源进行单一或者复合诱变已经得到大量的高产工业微生物菌株，在工业微生物的诱变中发挥着重要的作用。陈玲等采用不同的紫外线照射时间对产酶菌株孢子进行诱变处理，得到1株摇瓶发酵单位为500U/mL的菌株，比出发菌株的产酶能力提高了近30%。物理诱变方法并不是单一因素诱变，可选择多种诱变方式复合，以获得更优良的产柚苷酶菌株。 2.2.2化学诱变化学诱变的优点是经济方便（只需少量的药剂和简单的设备）、具有一定的专一性，应用广泛。陈玲等用亚硝基胍（NTG）对柚苷酶生产菌出发菌株孢子进行诱变处理，得到1株摇瓶发酵单位达770.06U/mL的菌株，比出发菌株的产酶能力提高了近100%。汪钊等用硫酸二乙酯（DES）处理产柚苷酶菌株，正变率高达