臨海熱水湧出域における耐塩性超好熱ウイルスの分子系統解析と有用.pdfVIP

- 185 - 助成番号 1220 臨海熱水湧出域における耐塩性?超好熱ウイルスの分子系統解析と 有用酵素遺伝子の探索 土居 克実１，藤野 泰寛２，田代 康介１ １九州大学大学院農学研究院，２九州大学基幹教育院 概 要 海洋の熱水湧出孔は、原始地球の環境を残し生命進化の過程を知る好材料であるが、アクセスに多大な困難 を有する。また、そのような環境に生息するウイルス?バクテリオファージ（ファージ）は、海洋の物質循環や遺伝子の水平 伝播に重要な役割を果たすと推測されているが、それらの研究例は僅かしかない。そこで、海底熱水湧出孔と近似した環 境を持つ臨海域の温泉からウイルスやファージを探索し、その性状を解析すると共に新たな遺伝子資源としての探索を 行った。 長崎県小浜温泉の堆積物（75℃, pH 7.5）を分離源として、好熱性?耐塩性ファージを分離した。それらのうち、ファージ ?OH2 はλファージ様の Siphoviridae 科に分類され、ファージ ?OH3 は Inoviridae 科に分類される繊維状ファージであっ た。?OH2、?OH3 は共に turbid plaque を形成し、溶原性ファージであると考えられた。これらファージの、熱?pH 安定性を 試験したところ、50～60℃、pH 5～9 で 90%以上の生残率を示した。また、両ファージの耐塩性を試験したところ、0.1～ 0.5 M で 80%以上の生存性を示した。 2 種のファージのゲノム構造を解析したところ、?OH2 は 38,099 bp の二本鎖 DNA で 60 個の ORF が推定された。これ らの ORF は溶菌酵素群、DNA 組換え酵素群、構造タンパク質群がクラスター構造をとっていた。一方、?OH3 は一本鎖 DNA をもち、宿主細胞中で二本鎖の複製形態（RF）をとることが分かった。?OH3 RF DNA は 5,688 bp で 6 個の ORF が 推定されたが、既報のタンパク質をコードする遺伝子との間に相同性は認められなかった。 これら耐熱性ファージ由来の酵素のうち、溶菌酵素 Endolysin と Holin の量産に成功した。活性部位の PGRP ドメインと 細胞壁結合部位の LysM ドメインを持つ ?OH2 Endolysin は Ni-NTA アフィニティーカラムで精製し、100 ng/ml で G. kaustophilus に対し溶菌作用を示し、活性の最適温度および最適 pH がそれぞれ 70℃と 7 であることが分かった。また、20 分間の加熱処理後、85℃では 90%以上、100℃でもおよそ 40%残存活性がみられ、優れた耐熱性を示した。さらに、pH 5 ～10 での 3 時間処理後でも、大きな活性の低下はみられなかった。G. kaustophilus 以外にも、宿主である T. thermophilus、 E. coli や L. johnsonii に対しても溶菌活性の確認ができた。これまで耐熱性溶菌酵素の報告例は少なく、特に PGRP ドメ インを持つ耐熱性溶菌酵素の機能解析としては本研究が初めての報告である。Holin は pColdTF を用い融合タンパク質 として発現させることに成功し、同様に優れた耐熱性、pH 安定性を持つことが示された。 １．研究目的 F. Twort によって 1915 年に発見されて以来、細菌ウイ ルスであるファージは地球上に１億種以上が存在すると推 測される膨大な未利用遺伝子資源である。ファージはそ れ ら の 形 態 や 保 有 す る 核 酸 分 子 の 種 類 に よ り 、 Siphoviridae、Myoviridae、Podoviridae、Inoviridae などに 分類されるが未だに全容は未解明である（Ackermann 2011）。その厖大な資源のうち、大腸菌に感染するλファ ージはファージベクターなどの遺伝子工学のツールとして 利用されており、M13 ファージはファージディスプレイによ る抗体生産に用いられ、さらに、T4 ファージは DNA リガ ーゼなどの供給源として幅広く用いられている。また、 - 186 - MRSA などの多剤耐性菌の出現により、治療困難な院内 感染症に対し、ファージセラピーが治療法として有効性を 示している（Henry and Debarbieux 2012）。 さらに有用なファージ（ウイルス）資源の探索には海洋 が重要な役割を果たすと考えられる。地表の多くを占める 海洋は生命起源の場であるが、海洋におけるファージ数 は 107/ml と算出されており、海の生態系や物質循環に重 要な影響を