蛋白质分离纯化-基础医学实验分解.ppt

一实验项目 蛋白质的盐析与透析 凝胶过滤法分离Hb与核黄素 （一）蛋白质的盐析与透析 盐析实验原理: 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷。 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即形成沉淀。 蛋白质的盐析与透析-原理 蛋白质的盐析与透析-原理 　　不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。 蛋白质的盐析与透析-实验操作 盐析 　　　　　　　血清1ml   　　 逐渐加入饱和(NH4)2SO4 溶液１ml ，边加边搅拌。  　离心 ３０００rpm 10分钟  　 　　　上清 　　沉淀（球蛋白） 逐渐加入固体 (NH4)2SO4 １％HCl 1-2滴 离心５分钟 沉淀（清蛋白） 透析实验原理: 蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。 在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分子物质。 按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留分子量。 蛋白质的盐析与透析-实验操作 透析 １．制备透析袋 ２．装样：取透析袋，将一端固定，由开口端加入含有硫酸铵的蛋白沉淀。 ３．透析：取10倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。更换洗脱溶液数次（约30min一次），至达到透析平衡为止。 ４．检查：（按教材步骤操作） 　　检查洗出液中是否有NH4＋；２支试管 　　蛋白检测：３支试管 又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式,垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大, 无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。 （二）凝胶过滤法分离血红蛋白与核黄素 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 凝胶过滤-原理 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 凝胶层析法分离蛋白质- 原理 血红蛋白（Hb，分子量64,480左右）与核黄素（分子量376）混合物，由于分子大小不同，通过Sephadex G-50层析受阻滞程度有差异，从而达到分离。 凝胶层析法分离蛋白质-器材 层析柱（1.5×25ml） 等 [试剂] 1.样品液：核黄素、Hb 2.Sephadex G-50 Hb的制备 抗凝血1ml 离心5分钟 3000rpm 上清 沉淀 10ml 0.9%NaCl 离心5分钟 3000rpm 沉淀 上清 重复两次 4倍体积 蒸馏水 上清 凝胶层析法分离蛋白质-操作 凝胶的制备与装柱： 向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50悬液，待底部凝胶沉积1~2cm时，打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm后，用3～5倍体积洗脱缓冲液平衡。 装柱注意点： 不得有气泡和分层； 凝胶表面应平整； 柱床体积稳定； 不能让凝胶表面露出水面。 凝胶层析法分离蛋白质-操作 2.加样： 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将样