二次熒光.ppt

荧　光　显　微　镜 王泽剑 上海交通大学药学院 基本知识 荧光的性质 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光染色分类： 自发荧光 二次荧光 抗体荧光技术 自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。 荧光的种类 抗体荧光技术（用免疫染色） 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 荧光的特性（1） 荧 光 的吸收光谱和发射光谱 大致对 称 于 某轴分布 ，形成镜象关系 荧光发出时不 象普通光那样 会产生热 效应 ，它是冷 光 。 荧光的吸收及发射光谱 荧光发光方向与激 发光的方向无关, 它呈 球体辐 射 。 荧光具有偏振性 一、荧光显微镜原理 原理： 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。 在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 荧光显微镜的基本构造 ： 由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 特点 荧光： 一般采用超高压汞灯(50-200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。 滤光片 激发滤光片：紧靠光源 UV:340-380nm 色玻璃 V:390-460nm 种类： B:460-500nm 干涉滤色片 G:500-570nm 截止滤光片：物镜与目镜间 阻断(或压制)滤光片： 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛。 选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 光学系统需完成的功能 荧光显微镜就其光路来分有两种： 1．? 透射式荧光显微镜 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。 透射荧光显微镜 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜 透射荧光显微镜原理 透射荧光显微镜的构造 优点： 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。 缺点： 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 厚的或不透明的标本不适用。 2．落射式荧光显微镜： 这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。 组成 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察