23第二十三章免疫细胞及其功能检验技术讲稿.ppt

免疫学检验 第二十三章免疫细胞及其功能检验技术 单个核细胞和淋巴细胞及其亚群的分离纯化原理。 T细胞及其亚群的表面标志和功能检测。 B细胞功能检测的方法和原理。 NK细胞的表面标志及其功能检测方法。 中性粒细胞和巨噬细胞的功能检测。 本章要点 目　录 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞等。 通过分离、纯化免疫细胞及其亚群，并对其数量和功能测定，可以判断机体免疫功能状态，对指导临床实践和科学研究具有重要意义。 前 言 第一节 免疫细胞的分离与纯化 免疫细胞的分离方法很多，主要根据细胞表面标志、理化性状和细胞功能等特征。 应根据实验目的、所分离的目的细胞群种类、数量和纯度等要求选择分离方法。 所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性兼顾细胞纯度和获得率。 一、白细胞的分离 （一）自然沉降法 加抗凝血于试管中 室温或37℃中静置 （30-60min） 分层 结果示意图 （二）高分子聚合物沉降法 抗凝血与等量3%明胶或6%右旋糖酐溶液混匀 室温或37℃中静置 （30～60min） 分层结果与自然沉降法类似 优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加 二、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴细胞和单核细胞。 PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。 细胞种类 密度 红细胞 1.093 白细胞 1.092 淋巴细胞和单核细胞 1.075~1.090 血小板 1.030~1.035 人外周血中各类血细胞密度 常用的分离液：Ficoll液和Percoll液 尤以密度为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll液）最常用。 （一） Ficoll分离法 注意：温度以20℃最适宜，超过25℃影响细胞得率 （二） Percoll分层液法 连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离心） 加入PBMC悬液或 抗凝全血 1000×g离心20min 结果示意图 三、淋巴细胞的纯化及亚群的分离 采用Ficoll和Percoll分离法获得的细胞悬液成分仍然较为复杂、均一性不佳。通常需要进一步分离纯化淋巴细胞及其亚群。 分离原理主要基于细胞的表面标志和功能等性质。 淋巴细胞及其亚类的分离纯化是免疫学检验与研究的重要基础技术。 （一）淋巴细胞的纯化 去除红细胞：低渗裂解法、氯化铵裂解法。 去除血小板：多次洗涤离心法、胎牛血清梯度离心法。 去除单核细胞：黏附法、羧基铁吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法 （二）淋巴细胞的分离 E花环沉降法 该法简便易行，主要用于T细胞的分离 PBMC悬液与SRBC混合 Ficoll法密度梯度离心 收集管底细胞并低渗裂解 （二）淋巴细胞的分离 尼龙棉分离法 该法简单快速，可分离T细胞和B细胞 PBMC悬液加入尼龙棉柱 37℃中静置1～2小时 预热的含小牛血清培养液洗脱 获得T细胞 冷培养液边冲洗边挤压 获得B细胞 （二）淋巴细胞的分离 免疫磁珠分离法 （二）淋巴细胞的分离 流式细胞术分离法 该法快速、细胞纯度和获得率高，可分离各种淋巴细胞及其亚群。 四、吞噬细胞的分离 吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中性粒细胞。 分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。 （一）单核细胞的分离 Percoll密度梯度分离法 流式细胞术分离法（常用方法） 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法） 黏附法 黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除单核细胞。 （二）巨噬细胞的分离 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞） 操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞） 操作要点：少量液体石蜡注入动物腹腔内，3~4天后冲洗出腹腔渗出液（70%~80%为巨噬细胞）。 （三）中性粒细胞的分离 右旋糖酐沉降法： 操作要点：抗凝静脉血与6%右旋糖酐溶液按比例混合，室温条件垂直静置一定时间后，红细胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白细胞沉降速度慢位于上层，获取上层细胞。 第二节 淋巴细胞数量及功能检测 许多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴细胞数量和功能变化。 数量检测：根据淋巴细胞及其亚群的表面标志。 功能测定：包括体内试验和体外试验。 一、T细胞数量及功能检测 （一）T细胞的数量检测 根据T细胞表面CD分子检测： （1）间接荧光免疫法 （2）免疫组织化学法