基因组DNA提取方法指导.docVIP

1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备 先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。 2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。 3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体） 4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去） 5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。 6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。 7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。 细菌基因组DNA的微量提取法 本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分 一：仪器：同方法一 二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL； 20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇 三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500μl TE缓冲液中混匀 30μl 10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时 100μl NaCL(5M) 混匀 80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃ 10min（可不做） 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀， 离心12000rpm,4-5min 取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。 注意 １，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。 细菌总DNA的提取和鉴定 【目的和要求】 1. 学会CTAB法提取细菌总DNA。 2. 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。 【实验原理】 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。 DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。 【实验试剂和器材】 （一）试剂： 菌株（E.coli）；蛋白酶K（20mg/ml）；琼脂糖；标准DNA水解液 1. 10%SDS 2．酚/氯仿/异戊醇（1/1/1） 3. 异丙醇；70%乙醇 4．LB培养基：蛋白胨10g,