附录XIVC细菌内毒素BP20082010.docVIP

C. 细菌内毒素试验（LAL试验）（BP） 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂（美国鲎或中国鲎）来检测或量化有革兰阴性菌产生的细菌内毒素的方法。细菌内毒素检查包括3种方法：以凝胶形成为基础的凝胶法，基于内源基质解离形成的浊度法，以及基于反应混合物形成后释放的呈色团的显色基质法。本章陈述了下列6种方法： 方法A. 凝胶限度试验 方法B. 凝胶半定量试验 方法C. 浊度动力学方法 方法D. 显色动力学方法 方法E. 显色终点法 方法F. 浊度终点法 供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除个论另有规定外，以方法A为准。 本实验操作过程应防止内毒素污染。 器皿 试验所用的玻璃器皿和耐热器皿需用已验证的方法除去热原，常用干热灭菌箱（250℃,30min以上）去除。若使用塑料器械，如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对对试验无干扰的器械。 注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板。 标准内毒素储备液的制备 标准内毒素储备液由经国际标准标定的内毒素标准品制备，如BRP标准内毒素。单位：IU，IU 为世界卫生组织规定单位。1IU=1EU 根据包装说明和标签规定制备及储存标准内毒素储备液。 标准内毒素溶液制备 混匀标准内毒素储备液，再用细菌内毒素用水与储备液制备系列稀释液。 尽快使用以防因吸附而失去活性。 供试溶液的制备 供试溶液的制备通过用细菌内毒素用水溶解、稀释药物或用具提取。某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释或提取。如有必要，调节待测溶液（或稀释液）的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。通常使用于pH范围在6.0-8.0的产品。pH的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。酸和碱可以在已去除内毒素的容器中用浓缩液或固体和鲎试剂水制备。缓冲剂必须进行验证无内毒素和干扰因子。 确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指供试溶液在可进行内毒素限值检测范围内被允许达到稀释的最大倍数。用以下公式来确定MVD： MVD = 内毒素限值 非肠道药物活性物质的内毒素限值以剂量定义，等于 K为人每公斤体重每小时接受的内毒素的临界值； M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。 在个论中，非肠道给药活性物质的内毒素限值的制定单位为IU/ml，EU/mg，EU/U（活性单位）等。 供试液浓度： ——若内毒素限值用重量（IU/mg）表示，则供试液浓度单位为mg/ml； ——若内毒素限值用活性单位（IU/U）表示，则供试液浓度单位为U/ml； ——若内毒素限值用体积（IU/ml）表示，则供试液浓度单位为ml/ml。 λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（IU/ml），或是在浊度法或显色基质法中所使用的标准曲线上内毒素的最低浓度。 凝胶法（方法A和B） 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或量化内毒素的方法。在标准条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保实验的精确和有效性，将在下面的准备实验中描述确认鲎试剂的标示灵敏度和干扰因子的实验。 1.凝胶法准备实验 鲎试剂标示灵敏度的确认实验 试验前先确认4个以IU/ml为单位标示灵敏度鲎试剂的平行管。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度确认试验。 鲎试剂标示灵敏度的确认至少要用一瓶鲎试剂。用细菌内毒素检查用水（BET）稀释标准内毒素储备液，制备至少4个浓度的USP RSE稀释液，浓度分别为2λ、λ、0.5λ和0.25λ。 取装有等容量（如0.1ml）鲎试剂溶液的试管，加入等体积不同浓度的内毒素标准溶液混合。如果使用单个测试量冻干鲎试剂的小瓶或安瓿，可直接加入上述溶液。在37±1℃下静置60±2分钟，避免震动。从恒温器中依次取出试管，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且不从管壁滑脱者为阳性；未形成完整凝胶者为阴性。最低浓度标准溶液显示阴性该试验才有效。 反应终点是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的实验。计算反应终点的对数平均值，再用以下公式求逆对数得平均值。 终点浓度的几何平均值=antilog（∑?/f） ∑?为系列反应终点浓度的总和，f为重复试验试管数。反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（IU/ml）。当这个值在0.5λ~2λ之间，标示灵敏度确认，并可用于内毒素检查。 凝胶法干扰因子试验 表2.6.14.-1 溶液 内毒素浓度/加入内毒素的溶液 稀释液 稀释倍数 内毒素浓度 平行试验次数 A B C D 未加入/供试品溶液 2λ/供试品溶液 2λ/BET用水 未附加/BET用水 —— 供试品溶液 BET用水 ——