实验四-五-目的基因的PCR扩增.pptVIP

实验四、五：目的基因的PCR扩增、PCR产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 一、实验目的 1. 教学目的：PCR反应、产物检测的基本原理与实验技术 2.能力目标：具有PCR扩增体系设计、参数设置基本能力，掌握扩增产物检测方法 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 二、实验原理 1.PCR(聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)原理:体外快速扩增特定基因或DNA序列 PCR动画 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 2.聚丙烯酰胺凝胶检测原理 聚丙烯酰胺凝胶有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成DNA分子通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有1-2bp 的DNA Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 三、仪器、材料和试剂 (一)仪器 PCR扩增仪、 琼脂糖凝胶电泳系统（琼脂糖水平电泳槽和电泳仪）、紫外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器（2,10,20,200,1000μl）、磁力搅拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. （二）试剂、材料 1.试剂：10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 、 dNTP混合物、 Taq酶、质粒DNA模板、引物对（正向引物和反向引物） 、PCR 管、丙烯酰胺、过硫酸胺、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺（TEMED）、Tris碱、硼酸、Na2EDTA·2H2O、冰醋酸、无水乙醇、Na2OH、AgNO3、甲醛、10 m mol/L dNTP混合物、 5U/uL Taq DNA聚合酶、10× PCR Buffer、50xTAE、引物对（鲤微卫星引物对）、过硫酸铵。 2.材料：1ng/ uL DNA模板 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 3.教师预备实验：引物对筛选。（说明，该引物对为教师科研过程中筛选引物对，参考文献：岳兴建, 邹远超，王永明等.元江鲤种群遗传多样性. 生态学报. 2013, 33(13).） Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 4.储存液 5×TBE 、10%过硫酸铵(AP) 、30%丙烯酰胺母液 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 四、实验步骤(一)PCR 1.PCR方案编制 6个样本/同学，建议编制8个样本量以便分样 取样后要标记 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004