Western Blot免疫足迹.docVIP

Western印迹法? 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 所有电泳的试剂，包括上样buffer，SDS配胶试剂盒，电泳buffer、蛋白Marker和蛋白染色试剂盒。第一步：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度进行凝胶的配制，可以使用SDS－PAGE凝胶配制试剂盒。第二步：进行蛋白变性，样品先置95℃的水浴加热5分钟，接着置冰浴中5分钟，10000g离心20分钟，取上清液（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月）。蛋白上样缓冲液可以使用5×SDS蛋白上样缓冲液。第三步依次加入预染蛋白分子量标准和待分析样品。 基本操作流程：提取细胞或组织蛋白、测定大致含量↓制备SDS胶↓蛋白样品变性、电泳↓电泳转膜↓封闭（2小时）↓一抗(4度过夜) ↓TBST洗涤（洗4遍）↓HRP标记的二抗（1.5小时）↓TBST洗涤（洗四遍）↓ECL试剂作用↓X-光片曝光、显影↓结果分析 详细操作流程 1.试剂 1.1 .SDS蛋白上样缓冲液1.2 SDS凝胶配制1M Tris-HCl （pH6.8）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至6.8（约14ml），定容至200ml，121oC 20min灭菌，室温保存。1M Tris-HCl （pH8.0）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.0（约8.4ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保存。1.5M Tris-HCl （pH8.8）:称取36.34g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.8（约5ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保存。10%（W/V）SDS:称取50gSDS，加400ml dd H2O，68℃加热溶解。滴加浓HCl调节pH值至7.2，定容至500ml，室温保存。30%（W/V）Acrylamide:称取29g Acrylamide，1g N，N’-至甲双丙烯酰胺（BIS），加dd H2O溶解，定容至100ml，用0.45m滤膜滤去杂质，4℃避光保存。20xPBS：称取Na2HPO4 11.5g，KH2PO4 2g，KCL 2g ,NaCl 80g，定溶至500ml蒸馏水中。10%（W/V）过硫酸铵:称取1g过硫酸铵，加10ml dd H2O 充分溶解，4℃保存（有效期约为两周）,分装于1.5的离心管中，每管1mL，-20度长期保存。1.3 SDS电泳液10×Tris-Glycine Buffer （SDS电泳缓冲液）:称取15.1g Tris，94g Glycine，5gSDS，加ddH2O 充分溶解，定容至500L，室温保存。 注：Tris和Glycine难溶，可70度水浴加热，并搅拌，室温保存。 SDS溶解易起气泡，常用50mL 10%的SDS代替固体配制。1×Tris-Glycine Buffer （SDS电泳缓冲液）:量取50ml 10×Tris-Glycine Buffer，定溶至500mL，混匀，室温保存。1.4 NC膜（硝酸纤维素膜）或PVDF膜1.5 Western转膜液10X电转液：称取2.9g Glycine，5.8g Tris，0.37g SDS，加ddH2O 充分溶解，定容至500ml，混匀，室温保存。 1X电转液：25mL 10X电转液，加100mL的甲醇，混匀，室温保存。1.6 洗涤液PBST Buffer:量取25ml 20×PBS，0.25ml Tween 20，加dd H2O定容至500mL，混匀，室温保存。1.7 封闭液称取1.25g脱脂奶粉，加入25ml TBST Buffer中，充分溶解，4 oC保存。1.8 一抗（可重复使用，置于4度冰箱） PBST 1mL 加一抗1ug ,配成1ug/mL,4度冰箱过夜。 次日，PBST洗膜4次。 二抗 （1:5000） 5%的奶粉：取0.25g奶粉，加5mLPBST,加1ug的二抗，于50mL大离心管，室温，1.5小时。之后，PBST洗4次。1.9 EasySee Western Blot Kit1.10 预染marker 1.11 BCA蛋白定量试剂盒 蛋白样品制备2.1蛋白粗提在人体中IgG占总抗体80%，成人血清中含量为12.5%/ml左右，IgG粗纯一