生物化学多糖综述.docVIP

植物多糖结构复杂，种类多样，分子量大，极性大，且常与蛋白质、脂质等结合成多糖复合物，生物活性也因其糖基的组成、排列顺序、连接方式、分支的位置等不同而相异，多糖骨架链间以氢键结合的各种聚合体，糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价键相互作用，多聚链间非共价键结合形成的聚集体，这些给多糖的提取分离带来了困难，加之多糖的提取方法和工艺尚未成熟和效率、成本等多方面的考虑，所以选择一种合适的提取分离方法对多糖的研究具有重大意义。 提取的多糖常混有蛋白质、色素等杂质，需进一步分离纯化，提高多糖纯度后，再对多糖组分进行分级。 2.1多糖中蛋白质的去除 蛋白质遇有机溶剂变性，常用氯仿与正丁醇按一定体积比组成的Sevage试剂，和三氯乙酸去除蛋白。也可根据酶的专一性选用蛋白酶，可除去大部分蛋白。蔡永红等〔25〕分别采用了Sevage法、三氯乙酸法和蛋白酶法去除栀子多糖中的蛋白质。Sevage法除蛋白后蛋白质含量为7.51%，三氯乙酸法为2.13%，蛋白酶法为4.23%。三氯乙酸作用强烈，除蛋白率较高。 Sevage试剂需重复多次，每次至少静置30min，时间较长，且有机试剂毒性较大及用量较多，多糖损失较高，还会对多糖的结构有破环。蛋白酶法作用温和，除蛋白效率高。欧文等〔26〕在除去荠菜多糖中的蛋白质时，采用Sevage法和三氯乙酸去除蛋白，蛋白去除率分别为80%、85.52%，而多糖损失率分别为20%、25.08%。而用木瓜蛋白酶法在酶用量为2.0%、pH5.5时作用2h，蛋白去除率为88.21%，多糖损失率为7.43%。蛋白酶法除蛋白率最高，多糖损失率最小。 2.2多糖中色素的去除 常用活性炭、过氧化氢、大孔吸附树脂除去多糖中的色素。活性炭吸附法一般去除鞣质色素。因活性碳疏松多孔无选择性，使多糖损失较多。李向东等〔29〕采用氧化氢去除黄芪多糖中的色素，并优化出最佳条件：每50mL样液用过氧化氢5~20mL脱色2~4h，色素除去率为92.05%。过氧化氢的氧化性较强，可能会造成多糖结构的改变，使用时应注意用量。 2.3透析法 透析法常用于多糖提取后的纯化，通常将粗多糖溶液装入透析袋，用自来水、蒸馏水透析。多糖是大分子物质，而盐类、小分子物质在溶剂作用下扩散出来。因此多糖可用透析法可以除去无机盐、单糖、双糖等，设备简单，无污染，能耗低。周鸿立等〔31〕用正交试验优化出透析玉米多糖的最佳条件：在30oС透析7h，更换缓冲液3次，多糖纯度由27.00%提高到42.35%，多糖损失率为9.25%，相对于其他除杂方法，多糖损失率较低。 2.4超滤分离 超滤是一种膜分离技术，具有分子筛作用，以压力差为动力，依据相对分子质量的不同进行分离。大分子物质流经膜表面，小分子物质在压力的作用下进入膜的另一侧。超滤膜常用于除杂和分离纯化大分子物质。将样品浸提后的溶液经超滤膜分离，可得多糖。焦光联等〔33〕用超滤膜分离黄芪多糖和大分子蛋白质多酚等物质，采用200kDa、10kDa的超滤膜在料液浓度20g/L、压力0.35MPa、温度30oС、进料流速0.467L/s最佳条件下，多糖含量由36.0%提高到86.8%。超滤膜可以连续使用，并保持较好的分离效果。不损坏多糖的活性，不需要添加化学试剂，设备简单，能耗低，无污染。醋酸纤维素膜是分离多糖最常用的一种膜。膜分离过程中浓差极化和膜污染等造成的膜渗透通量下降，加之多糖结构的复杂性，其分离、提纯难度较大。且活性多糖一般属于大分子化合物，有黏性，在膜分离过程中更易产生膜污染和堵塞。 2.6金属络合物法 多糖中的游离蛋白和色素可用金属络合物法分离，多糖能与一些金属离子形成络合物而沉淀。常用的是铜盐沉淀法，Fehling试剂沉淀木聚糖、甘露聚糖，最后再用硫化氢去铜得到纯糖。王海林等〔36〕根据油茶籽多糖C中含有特异性磷酸基团，采用Cu2+亲和层析法，金属离子与磷酸基团产生螯合作用结合到琼脂凝胶上，再用磷酸盐缓冲液洗脱，油茶籽多糖C得到纯化。与传统方法相比，亲和层析能更有效地去除油茶籽多糖C里残留的蛋白质。 2.7离子交换柱层析 纯化多糖常用柱层析，能有效精分多糖组分，作用温和，能较好的保持多糖的结构和生物活性。常用的柱层析方法有大孔树脂柱层析、阴离子交换柱层析和凝胶柱层析。 2.7.1大孔吸附树脂纯化： 冯磊等〔37〕采用X-5非极性树脂吸松茸多糖，吸附率达30.85mg/g；50%丙酮洗脱率达81%，多糖含量提高15%。吸附-脱附一步工艺即可提高多糖含量，操作简单，适于工业化生产。汤伟等〔38〕用AB-8、DB-301型号的大孔吸附树脂纯化丹参多糖，经不同浓度的乙醇洗脱得到的粗多糖纯度由40.35%提高到78.72%、80.45%，且能降低蛋白含量和良好的脱色效果。徐怀德等〔39〕优选出AB-8