20140121禽流感病毒通用性内标测试与优化实验方案(修改).docx

禽流感病毒通用性内标测试与优化荧光RT-PCR试验方案一、试验目的1.测试禽流感病毒通用性内标进行荧光RT-PCR试验情况，包括内标能否进行扩增、最低浓度（最大Ct值）内标的选取与加入反应体系中的量等。2.测试禽流感病毒通用性加内标与不加内标进行荧光RT-PCR试验灵敏度的影响。二、试验原理禽流感病毒通用性内标基因序列与禽流感病毒通用性所检测的RNA片段序列一致，使用相同的上、下游引物，不同的荧光探针进行荧光RT-PCR试验，属于竞争性内标。三、试验材料已知浓度（Ct值）禽流感病毒H5亚型抗原提取RNA；禽流感病毒通用性内标；禽流感病毒通用性上、下游引物及荧光探针；内标荧光探针；Master Mix；Taq酶与逆转录酶；制备假病毒相关材料与离心柱提取试剂等。四、试验步骤1.2.25am 测试合成的禽流感病毒通用性内标进行荧光RT-PCR情况：1）根据内标管壁标注，使用相应量DEPC水进行溶解(20μL），取1μL进行试验使用，其余-20℃保存。取1μL内标原液进行10倍的倍比稀释，稀释成5种浓度的内标。2）配制50T内标P Mix，荧光RT-PCR反应体系的配制材料1T（μL）9T（μL）Master Mix654内标P Mix19Taq 酶0.54.5AMV 酶0.54.5模版2/DEPC H2O15135Total25207将9T反应液加入到7个反应孔中，每孔23μL，前5个反应孔依次加从低到高稀释浓度的内标，每孔2μL，后2孔加DEPC水做阴性对照。结果：2.通过低浓度内标进行荧光RT-PCR情况，确定最大Ct值又能特异扩增的内标浓度：1）根据1试验结果，选取出Ct值为30以后且有明显特异性扩增曲线的稀释内标（10-9），再进行3倍倍比稀释，稀释成Ct值相差约为1的四种浓度内标（10-9、10-9.5、10-10、10-10.5、10-11），再进行荧光RT-PCR试验，确定能进行特异性扩增的最低浓度内标。2）荧光RT-PCR反应体系的配制：材料1T（μL）8T（μL）Master Mix648内标P Mix18Taq 酶0.54AMV 酶0.54模版2/DEPC H2O15120Total25184①2.25pm 将8T反应液加入到7个反应孔中，每孔23μL，前5个反应孔依次加从低到高稀释浓度的内标，每孔2μL，后2个孔加DEPC水作为对照。根据试验结果，选择最适浓度内标（Ct值约36左右）。结果：10-9 Ct值为35.805，符合能进行特异性扩增的最低浓度内标（Ct值约36左右）。②2.26am根据2.25am的结果，可以进行的下一步实验，虽然实验当天有错误，但内标10-9没有扩增曲线，结果如下：③2.27am 根据2.26am结果，怀疑实验室有污染，决定再做10-8、10-8.5、10-9，做4个平行副孔，并用TE做阴性对照，结果如下：根据结果，最后还是确定用内标浓度为10-9进行最低浓度内标对低浓度禽流感病毒H5亚型抗原荧光RT-PCR的灵敏度影响的测试。3.2.27pm 测试最低浓度内标对低浓度禽流感病毒H5亚型抗原荧光RT-PCR的灵敏度影响：1）选择Ct值为36~39左右的四种浓度禽流感病毒H5亚型抗原RNA，进行荧光RT-PCR试验，配制50T内标与禽流感病毒通用性P Mix：材料1T（μL）50T（μL）100 uM F0.15100 uM R0.15100 uM 禽流感病毒Pb0.052.5100 uM内标Pb0.052.51×TE0.735Total1502）荧光RT-PCR反应体系的配制：材料1T（μL）14T（μL）Master Mix684内标与禽流感病毒通用性P Mix114Taq 酶0.57AMV 酶0.57H5亚型抗原RNA5/模版228DEPC H2O10140Total25280将14T反应液加入到14个反应孔中，每孔20μL，前4孔加浓度为10-6的禽流感病毒H5亚型抗原RNA5μL和浓度为10-9的内标2uL，后四孔加浓度为10-6的禽流感病毒H5亚型抗原。第二个八联管前4孔加浓度为10-5的禽流感病毒H5亚型抗原RNA5μL和浓度为10-9的内标2uL,后两孔加DEPC水作为阴性对照。结果如下：10-6抗原对内标的竞争性抑制明显，而10-5抗原对内标的抑制作用不明显。