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重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建 分子生物学实验-实验操作 基因、载体、受体菌株 基因 载体 菌株 质粒 酶切连接 转化 质粒提取 PCR 实验技术要求 应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳 考察指标 电泳、蓝白斑数量 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳 实验流程: 第一天 8AM-5PM rhIL-18基因的PCR产物 质粒pUC18 BglⅡ和PstⅠ双酶切 BamHⅠ和PstⅠ双酶切 浓度1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶回收与溶液回收 电泳检验 T4连接酶连接过夜 配制 LB 液体与固体平板培养基 灭菌 37℃过夜培养 E .coli JM109菌株 实验流程: 第二天 8AM-5PM CaCl2 法制备E.Coli JM109感受态细胞 实验组连接体系 42℃热激转化90s 37℃温柔孵育45min 涂布平板 37℃过夜倒置培养 实验流程: 第三天 1PM-5PM 观察阴性对照组菌落生长情况 有无菌落 挑取1白色单菌落 37℃液体培养基过夜培养 观察实验组菌落生长情况 统计蓝斑，白斑菌落数量 观察空菌对照组菌落生长情况 统计菌落数量 实验流程: 第四天 8AM-5PM 提取质粒DNA 浓度1%琼脂糖凝胶电泳 PCR 浓度1%琼脂糖凝胶电泳 双酶切反应（20μL体系） rhIL-18的PCR产物 目的基因 6.8μL 无菌水 9μL BSA 0.2μL BglⅡ 2μL PstⅠ 2μL 质粒pUC18 质粒 10μL 无菌水 6μL BamHⅠ 2μL PstⅠ 2μL 37℃酶切反应3小时。 Hybrid site 培养基配制 LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加0.2mL 5mol/L NaOH ，调节pH值至7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 3个30ml 液体培养基 120ml 固体培养基 灭菌 5个培养皿 3个30ml LB 液体培养基 1个120ml LB 固体培养基 一个50ml 离心筒 微量移液器枪头 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 DNA 的分子大小 琼脂糖浓度 DNA 分子的构象 电源电压 嵌入染料的存在 离子强度影响 琼脂糖凝胶制作图示 琼脂糖凝胶的配制 称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1×TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。 取出稍冷后加入3μL基因染料，混匀。 将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。 冷却。 琼脂糖凝胶回收 琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒 分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收 1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2.将单一的质粒条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3.向胶块中加入3倍体积胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，依此类推）。50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。（将目的基因体积补至50μL，由此步平行操作。） 注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。 琼脂糖凝胶回收 4.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。 5.向吸附柱CA2中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 6.向吸附柱CA2中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉废液。 7.将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 注意：漂洗