情绪对大鼠脑出血CNS损伤修复幻灯片.pptxVIP

邹鹏 孙普阳 情绪对大鼠脑出血CNS损伤修复的影响 Living in Passion The Effect of MOOD What about the CNS injury repair? Purpose Principle 在应激状态下，交感神经一肾上腺髓质系统(SAS)和下丘脑一垂体一肾上腺皮质(HPA)轴兴奋，血清儿茶酚胺(CA)和肾上腺糖皮质激素(GC)含量上升。而持久的情绪应激导致机体神经内分泌免疫功能紊乱可能加速大脑损伤神经元的凋亡，从而影响CNS损伤的修复； 内啡肽类激素如五羟色胺对于大脑具有兴奋作用，产生愉快的感觉，音乐刺激可促进大脑内啡肽的分泌，可以以此模拟积极情绪。通过对大鼠进行不同的情绪处理，来研究情绪对大鼠脑出血损伤修复的影响; 通过对大鼠脑内神经再生标志物GAP-43蛋白表达水平的检测，可确定受损CNS修复的程度及神经元的再生情况。 Materials 实验对象 体重接近，成年Wistar 大鼠 实验试剂与器材： 手术器械一套 音乐播放装置 Western blotting相关器材 Experimental Procedure 大鼠脑出血模型的建立 模型筛选分组 对各组大鼠的恢复情况检测 对各组大鼠进行相应情绪处理 脑出血模型建立 大鼠固定 脑出血模型建立 术后缝合修复 筛选成功模型分组 Berderson神经体征评分法： 轻抓尾巴,提起高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直 愤怒刺激组 音乐安抚组 空白对照组 恢复情况检测 (1)Berderson神经体征评分法： 轻抓尾巴,提起高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直 0分 1分 2分 3分 平均值U1 空白组 沉默组 音乐组 愤怒组 统计如下表格： 恢复情况检测 (2)Western blotting检测出血侧GAP--43的表达： 脑组织加裂解液匀浆后，离心取上清，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配12％分离胶行蛋白SDS—PAGE变性电泳，电泳结束后，将蛋白电转印至NC膜：1％脱脂奶粉封闭1 h；加兔抗GAP-43抗体(1：1000)4~C过夜；TBST洗膜3xlO ；HRP标记羊抗兔I gG(1：1000)室温孵育2 h；TBST洗膜3×10 ，ECL化学发光法显影。实验重复3次。采用ImageMaster(r)VDS凝胶成像及分析系统，于可见光下采集底片上的蛋白条带图像，通过与相应B—actin条带密度比较．计算各条带密度相对值，然后取组内平均值，记为U2。 (3) 各组大鼠脑组织形态学的光镜观察： 过量麻醉,迅速开胸暴露心脏,从左心室插管至升主动脉根部,在右心耳处剪开一小口做出口。经麻醉鼠的左心室顺序灌注4℃生理盐水和4%多聚甲醛/0. 1MPB各约200 ml。4℃生理盐水200 m l快速灌注, 之后稍减慢灌注速度冲洗至流出的血水变淡后,换4%多聚甲醛200 m l快速灌注,之后稍减慢灌注速度继续固定灌注,待肝脏及肢体变硬后断头取脑。距注射针孔前后各约2 mm冠状切开,切下厚4 mm的脑片将其马上放入含有1‰DEPC的4%多聚甲醛固定液中固定,然后按常规脱水、浸蜡、包埋制成厚度5 um的石蜡切片用于HE染色，观测各组结果。 Discussion Western Blot杂交方法 音乐促进作用 设计沉默组的原因： 刺激音乐的选择 采用Wistar大鼠的原因： Wistar大鼠对比SD大鼠在学习记忆方面，平均水平较高且方差小。 为了消除颅骨损伤对实验的干扰。 实验中音乐组的刺激音乐采取与大鼠心率一致的旋律，根据音乐疗法理论，对于人类而言，听与自己心跳同节奏的音乐有利于人的大脑产生兴奋和愉快的感觉，因此我们对大鼠采取了类似的处理方法。 最后多项检测指标提示，音乐的刺激确实对大鼠脑充血损伤后的CNS修复确实有促进作用。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Results 音乐安抚组对比对照组，音乐安抚组评分均值U1小于对照组； GAP-43蛋白水平U2大于对照组，说明音乐对损伤大鼠脑神经元有的修复有促进作用。 愤怒刺激组对比对照组，愤怒刺激组评分均值U1大于对照组；GAP-43蛋白水平 U2小于对