SELDI-MS,ALDI-TOF-MS和二维电泳做蛋白的对比.docVIP

SELDI－MSMALDI－TOF-MS二维电泳SELDI技术最大的检测值为150KD，但是由于其飞行时间检测管较短，一般检测分子量范围是1000－20KD,其检测的最佳分子量范围是2000－10000。买MS过程中，有机会与Ciphergin公司的技术部主任交流过几次SELDI-TOF技术最大的检测值最大好象可以做到300KD，在30KD以下比较好根据的一次实验结果，从峰型上看比较的好的范围应该是3000-20000。MALDI－TOF-MS理论上可以达到500KD以上，但是实际应用中能够检测的值也在300KD以下。TOF－MS不是鉴定蛋白用的，自然只能测出分子量。因为SELDI的TOF性能有限，因此用SELDI检测，只能得到蛋白的分子量，而无法鉴定蛋白。即使使用芯片原位酶解，做PMF，由于分子量误差可大2，因此准确度不够。Ciphergen的PBSII仪器说明书上标注可以测到500KD，跟据我们的经验，只要实验控制和芯片选择的好，100KD－250KD的蛋白都可以做出很漂亮的结果。如果操作傻瓜化，500Da－60000Da是有效的检测范围。SELDI检测大分子量蛋白效果差一些，不是飞行管长度的问题，飞行管长度可以决定分辨率，同时影响灵敏度。实际上，飞行管越长往往越不容易做高丰富的大分子量蛋白质检测。SELDI原理本身决定了它在有大量小分子量蛋白或者肽存在时，大分子量蛋白的检测必然要差一些MS测定蛋白分子量的一个重要目的就是鉴定蛋白质。如果用TOF－MS做PMF，自然能鉴定蛋白，只不过与目前的MS/MS比成功率比较低而已。在MS/MS 问世之前，用TOF-MS鉴定蛋白是经典的方法。军科院、复旦等处鉴定蛋白的一般流程就是：PMF(鉴定出50%)------MS/MS（PST）（鉴定出70-80%）-------sequence（de novo）（80-95%）如果在SELDI芯片上原位裂解蛋白，自然可以做PMF，一样可以鉴定蛋白。再加上不同PH酸洗脱的办法，用SELDI-TOF还可以测出蛋白的PI。有了MW和PI，再加上已知的样品信息（如物种来源，可能的功能等），检测的是什么蛋白，基本就可确定。根本就不适合用SELDI-TOF做。极度复杂的混合蛋白的肽段，目前也只能通过shot-gun技术，也就是LC/LC-MSn，质谱检测器用离子阱。一般复杂的肽段混合物，液质联用的质谱如Q-TOF和Q-STAR比较适合。SELDI-TOF的最大特点就是根据不同蛋白具有不同的分子量，而达到分辨两个样本之间差异的目的，它 的功能目前也仅限于此。样品消化成肽段后，既使图谱很好，因为没有功能强大的质谱支持，不能确定肽段的来源，因此结果毫无用处（就我目前所知）。二维电泳对于5000以下的分子基本上检测不到，用TRICINE的效果也不好，因此对于小分子量《10KD的蛋白分子，直接用SELDI检测效果最好。由于二维电泳中有平衡一步，因此在平衡的过程中小蛋白分子会从IPG胶条中“漏”到平衡液中，因此对于10KD的蛋白分子，2D无法检测，即使用TRICINE无能为力。但也不是所有蛋白都会漏出，所以可能会得到一些小分子蛋白。若要得到尽可能多的小分子，最好缩短平衡时间，减少非必须的平衡。Autoflex Ⅲ? MALDI TOF飞行时间质谱仪, 他的功能介绍说可以测序的。附上参数供懂行人参考：1．质量范围： 500,000 Da 2．分辨率： 线性分辨率 4,000 （样品为多肽） 反射模式的分辨率 20,000（样品为胰岛素） 3。灵敏度: 线性模式的灵敏度: 1fmol，信噪比大于100：1 （样品为多肽） 反射模式的灵敏度: 1fmol，信噪比大于100：1 （样品为多肽） 100 attomol ，信噪比大于20：1（样品为neurotensin） 4．分辨率和灵敏度 能同时获得高分辨率和灵敏度 分析10fmol/ul ACTH clip 18-39，可获得10,000分辨率 5． 质量准确度 线性模式质量准确度 内标法：质量准确度≤ 35ppm (多肽) 外标法：质量准确度≤ 100 ppm 反射模式质量准确度 内标法：质量准确度≤ 10 ppm （多肽） 外标法：质量准确度≤ 50 ppm 串联质谱模式质量准确度：≤ 150 ppm 6．串联质谱功能 拥有LID（Laser induce dissociation）、CID(collsion induce dissociation)、ISD(in source decay) 以及LIFT 等不同的串联质谱功能，其中CID的碰撞能量可达8Kev,能能够区别亮氨酸与异亮氨酸。 MS/MS预选离子能力强： 分辨率大于200（FWHM） 串联质谱的