猪水肿病与副伤寒病猪肝脏中病原菌的分离与鉴定.docVIP

微生物实践教学结题报告 题 目猪水肿病与副伤寒病猪肝脏中 病原菌的分离与鉴定 指导老师： 蒋文灿 班 级： 动检201101 二〇一三年十二月 猪水肿病与副伤寒病猪肝脏中病原菌的分离与鉴定 陈德林 梁慧明 陈前 曾雅丽 黄莞芸 张鹏飞 郑新疆 谢念 王传富 尹旭林 （四川农业大学动物医学院动植物检疫（动物检验检疫）201101） 指导老师：蒋文灿 摘要：肠杆菌科的细菌种类众多，在自然界中管饭分布，能引起人和动物的多种传染性疾病，尤其是消化道疾病，具有极其重要的公共卫生学意义。该科成员的形态相似，但各种细菌的生化特性较为稳定具有重要诊断意义。本文将就猪引起猪水肿病的大肠杆菌和引起猪副伤寒病的沙门氏菌做分离与鉴定的简要介绍。 关键词：大肠杆菌；沙门氏菌；分离；鉴定 1 实验依据 肠杆菌科的细菌种类众多，在自然界中管饭分布，能引起人和动物的多种传染性疾病，尤其是消化道疾病，具有极其重要的公共卫生学意义。尤其是能引起猪水肿病的大肠杆菌和引起猪副伤寒病的沙门氏菌是其中最为人所知的，虽均为三类疫病，但因其四季均发的特性每年均给我国的养猪产业，特别是农村地区的养殖户带来巨大的经济损失。据世界卫生组织统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。中毒后会产生严重的腹泻等消化道疾病症状，因此具有重要的重要诊断意义。 2 材料 2.1　样品来源　从宰杀猪的肝脏无菌采集样品。 2.2　试验试剂 四硫磺酸钠煌绿（）增菌液、麦康凯琼脂、三糖铁培养基、营养肉汤和营养琼脂。鉴定用生化管（硫化氢、靛基质、ｐＨ尿素、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、ＭＲ、ＶＰ、枸橼酸盐） 2.3 实验器材 试管平板高压蒸汽锅接种环凝集板烧杯量筒锥形瓶电子天平移液枪及枪头等2.4 培养基及制备方法 2.4.1普通营养肉汤（150 ml）按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类在称取蛋白胨及牛肉膏）置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏（5 g）蛋白胨（10 g）氯化钠（5 g）磷酸氢二钾（1 g）蒸馏水（1 000 ml） 将上述成分混合加热溶解后，以0.1 mol/L氢氧化钠溶液调整酸碱度至PH7.4~7.6。 将配好的肉汤分装于试管和锥形瓶中，塞上棉塞，用包装纸扎好待灭菌。 将培养基置于高盐蒸汽锅内，121 ℃灭菌15~30 min。 2.4.2 麦康凯琼脂培养基(50 ml) 蛋白胨 17 g脙胨 3 g猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5 g氯化钠5 g琼脂17 g乳糖10 g蒸馏水1 000 mL0.01%结晶紫水溶液10 mL0.5%中性红水溶液 5mL将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400 mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600 mL加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121 ℃高压灭菌15 min备用。 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55 ℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。 结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。 2.4.3四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB) 基础液蛋白胨10 g牛肉膏 5 g氯化钠 3 g碳酸钙 45 g蒸馏水1 000 ml除碳酸钙外，将各成分加如蒸馏水中，搅拌混匀，静置约10加热煮沸至完全溶解，再加入碳酸钙，调至PH7.0±0.1，高压灭菌121 ℃，20 min。 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含5个结晶水）50 g蒸馏水加至100 ml，高压灭菌121 ℃，20 min碘溶液碘片 20 g碘化钾 25 g蒸馏水加至100 ml将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片完全溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，储存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 0.5% 煌绿水溶液煌绿 0.5 g蒸馏水100 ml溶解后，存放暗处，不少于1 d，使其自然灭菌。 牛胆盐溶液牛胆盐10 g蒸馏水100 ml加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121 ℃，20 min。 制备基础液900 ml硫代硫酸钠溶液100 ml碘溶液 20.0 ml煌绿水溶液 2.0ml牛胆盐溶液 50 ml临用前，按上列顺序，以无菌操作一次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。 2.4.4三糖铁琼脂培养基2.4.5 伊红美蓝琼脂培养基 3 分离鉴定方法 3.1猪副伤寒病原菌分离鉴定方法 3.1.1菌株鉴别分离及纯培养　将取自猪肝脏无菌样品2 h内置于高压灭菌的缓冲液中混匀，用无菌吸头吸取混合液40μＬ接种于4增菌液(×2)，℃条件下培养～后，用接种环取增菌液１环划线接种于一个麦康凯琼脂，将可疑单个菌落接种另一麦康凯琼脂进行纯化，再将纯化的菌落接