葡萄酒中8种生物胺的测定详解.ppt

葡萄酒中8种生物胺的测定 采用高效液相色谱法，柱前衍生，以1,7-二氨基庚烷为内标，测定葡萄酒中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺含量。 生物胺简介 生物胺是一系列含氮低分子有机碱, 可分为单胺和多胺两类, 包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质。 生物胺除了存在于各种动植物的组织中，还普遍存在于多种食品中，尤其是发酵食品如奶酪、发酵香肠、啤酒、黄酒、葡萄酒中等。 生物胺的作用 微量的生物胺是生物体内正常的活性成分， 在生物活性细胞中具有重要功能，其中多胺对细胞的生长和增殖具有重要作用。 生物胺作为药用( 鹿茸中的药用成分) 有重要的生理功能, 如: 促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压, 并在神经系统中有活性, 在消除自由基方面也有一定的作用等。 过量摄入的危害 当人体摄入过量的生物胺时，就会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。 生物胺中以组胺对人体健康影响最大，海产鱼中的青皮红肉鱼类含组胺较高，当鱼不新鲜或腐败时，鱼体中游离的组胺酸经脱羧酶作用产生组胺。 许多国家已经作出了葡萄酒中组胺的限量范围。 澳大利亚、匈牙利和瑞士--10 mg/L 法国--8 mg/L 比利时--6 mg/L 荷兰--3.5 mg/L 德国--2 mg/L 我们国家鱼类中组胺的限量 鲐鱼—100mg/100g 其他含组胺的鱼类—30mg/100kg 葡萄酒中的生物胺 葡萄酒中的生物胺含量与葡萄品种、气候条件、葡萄卫生状况、酒种、酿造工艺、储存条件等诸多因素相关。 曾有报道研究了葡萄牙产区不同年份的葡萄酒中生物胺变化 在2003 年的葡萄酒中，酪胺和异戊胺的含量较高 在2004 年的葡萄酒中，腐胺为主要的生物胺 这可能是由于不同年份气候条件的变化，自然的微生物菌群与葡萄组分的不同而引起这种差异。 高效液相色谱法测定8种生物胺原理 生物胺自身没有荧光和紫外的发色基团,因此需要经过衍生化处理，才能在色谱仪器检测出来。 丹磺酰氯（Dns-Cl）可以和伯胺或仲胺基上的活泼氢发生反应，脱掉一分子的HCl，生成具有紫外和荧光的衍生物。 以1,7-二氨基庚烷为内标，经过氯仿－正丁醇（1：1）液液萃取净化后，以丹磺酰氯为衍生剂，60℃衍生30min，采用C18柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。 样品处理—萃取 量取葡萄酒5mL，加入适量氯化钠使溶液饱和。准确量取上述饱和后的试样提取液5mL，置于15ml离心管中，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至12.0。 加入5mL的正丁醇－氯仿(1:1)混合液，涡旋振荡5min，3600r/min离心10min，吸取上层有机相，再重复萃取2次，合并萃取液，混匀，取3mL萃取液并加入0.2mL1mol/L HCl ，混合后40℃水浴下氮气吹干，加入1mL 0.1mol/L HCl 复溶，待衍生。 样品处理—衍生 取上述待衍生的试样溶液0.5mL 置10mL具塞试管中，加入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL（5mg/mL丙酮）丹磺酰氯衍生剂，振荡使混匀。 置60℃培养箱中反应30min，中间振荡2次，取出，分别加入100μL谷氨酸钠（50mg/ml饱和碳酸氢钠溶液），振荡混匀，60℃保温15min。 取出，每个试管中加入1mL超纯水，在40℃水浴用氮气除去丙酮。加入3mL乙醚，振荡2min，静置分层后，吸取出上层有机相（乙醚层），重复萃取2次，合并乙醚萃取液，氮气吹干。 加入1.0mL甲醇使残留物溶解，振荡混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，滤液待测。 标准系列 分别移取0.5mL的1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L生物胺标准系列溶液，分别置10ml具塞试管中。 依次加入20μL（100mg/L）内标使用液，加入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL（5mg/mL丙酮）丹磺酰氯衍生剂，振荡使混匀。置60℃培养箱中反应30min，以下操作同试样的衍生步骤。 液相色谱参考条件 色谱柱为C18柱， (150 mm×4.6mmID，5μm)，紫外检测波长254nm，进样量10μL，柱温30℃，流速：1.5mL/min。 梯度洗脱程序 流动相A为甲醇溶液，B为超纯水。 时间 0 7 14 20 27 30 35 36 45 流动相A 55 65 70 70 90 100 100 55 55 流动相B 45 35 30 30 10 0 0 45 45 标准色谱图 1－色胺，2－β-苯乙胺，3－腐胺，4－尸胺，5－组胺，6－1,7二氨基庚烷(内标)，7－酪胺，8－精胺，9－亚精胺 计算 X = A×f/V×1000 X——试样中生物胺的含量，单位为毫