蛋白质的相互作用研究方法详解.ppt

GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。 GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程 GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程。 膜蛋白的移动 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） 蛋白之间的相互作用（FRET） 报告分子 将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检测基因表达的时间和部位。 人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。 其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白 青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移 Look at physical interactions between proteins 四、Bimolecular Fluorescent Complementation 五、Yeast Two－Hybrid Systerm 1.原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-activating domain的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。 1）两种蛋白之间是否有相互作用 2）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白 2. 应用 （1）它并非对所有蛋白质适用。 融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛查结果. 3. 双杂交系统的缺陷 （2）假阳性的发生较为繁多。 在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型：Ⅰ型：表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录。Ⅱ型：表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录。Ⅲ型：表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。 3. 双杂交系统的缺陷 （3）在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖。 （4）还应意识到的一点是，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用，但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的 。 蛋白质与小分子化合物的相互作用是进行药物设计的基础。基于结构的药物设计在药物的研发中已取得较大的成功，近年来通过化合物数据库与蛋白质结构的分子对接进行虚拟筛选大幅度地提高了先导化合物发现的成功率。 * LoojLook 两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。 使蛋白质到发挥作用的位点。 使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。 蛋白质的相互作用 蛋白质－蛋白质相互作