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细胞培养 一 原代培养（略） 二. 传 代 培 养 准备及注意事项 换 液 传 代 冻 存 复 苏 MTT 准备事项 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分钟后方可进入实验室. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 带手套,并用酒精擦拭之. 准备好实验必需用品. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 超净工作台内操作完成后， 要用酒精棉球擦拭台面,除了酒精灯,镊子,试管架等物品外,其他都要拿出工作台外. 紫外灯照射30分钟. 换液 把细胞培养瓶从培养箱中拿出, 拧紧盖子; 观察瓶内培养基的颜色, 是否浑浊等; 放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 放入超净工作台内,点燃酒精灯,拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒. 取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口; 拿出PBS液瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将塞子取出,烧瓶口（至少10圈）。 6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口， 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取5ml-8ml的培养基打入培养瓶内，烧瓶口， 镊子和盖子； 9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。 注意： 1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。 传代 1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。 6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出； 10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。 11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。 冻存 1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养瓶口和盖子，盖上盖子； 9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟后取出； 10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞变成单个圆形，则可进行传代。 11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。 14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。 15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。 16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多个冻存管中，每管1.5ml。 17.盖上盖子，用封口膜封好,标上细胞名称和日期 . 18.冻存方式：4℃30分钟，-20℃15分钟，-80℃60分钟，最后转移到液氮罐内。 注意： 冻存管移动时要夹在冰块中间。 复苏 1.