08-3h-定点突变与基因打靶技术(李冬民)课案.ppt

定点突变与基因打靶技术;第一节 基因定点突变;基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。 根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.随机突变 表型筛选 2.位点特异性突变 定点突变 ;点突变：指单个碱基的突变，简而言之突变发生在基因的一个点上，故称点突变 点突变的类型 1）碱基替换 a.转换：同类碱基间 b.颠换：不同类型间的碱基 2）碱基的增加及缺失 ;点突变的分子效应： 突变发生在基因编码区 a.同义突变:由于遗传密码有兼性，若突变的密码子编码同样的氨基酸一般对蛋白质的结构和功能没有影响 b.错义突变:碱基对的置换使mRNA的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变;c.无义突变（nonsense mutation ）：是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码???，从而使肽链合成提前终止。 编码氨基酸的密码子突变为终止密码子，使肽链合成中断。 ; 1.定义：按照人们的意愿对基因的编码区和表达调控区定向进行缺失、插入或碱基替换等过程。 ;3.定点突变的类型;DNA定点突变的种类 寡聚核苷酸介导 替换、插入、删除 盒式突变 PCR介导;III.基因定点突变;（1） 寡聚核苷酸介导法;Kunkel法或称 “U” 法; 在dut+的E. coli中 　 dUTP dUMP　 在dUTP 酶缺失体中（dut- ） 　 dUTP dUMP ;Kunkel法或称 “U” 法; 在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 在大肠杆菌dut- ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。 此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。;????① 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。 ????② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶） ????③ M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。 ????④ 与引入诱变的 Oligo 复性。????;????⑤ 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。 ????⑥ 感染 dut+ ung+ E.coli　MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。;; 这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。;要求 5’ 端磷酸化。 引物的终极条件： 与靶 DNA 正确配对 特异性地与靶 DNA 序列退火。 ;A.单核苷酸置换插入或缺失 ?5’ 端完全配对，使得上游（引物）起始的 DNA 合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需 8-10bp 。 3‘ 端所形成的杂交体足以引导 DNA 合成。如果错配核苷酸太靠近 3’ 端， 3‘ 端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以 3’ 端需有 7-9bp 完全配对； 为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般 17-19bp ，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。;B.多处缺失或变换 2 个 bp 以上的 oligo 两侧需 12-15bp 侧翼双链区的 Tm 应约为 35-40℃ ????Tm = 4 （G + C） + 2 （A + T） 突变区域大，效率越低（两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→ 越低）。;;3. PCR介导的基因突变;;（2）重叠延伸PCR诱变法（Overlap extension）;该方法需要4个引物, 包括2个含有突变碱基的反向互补的引物,2个上、下游通用引物。 整个诱变过程需要3个PCR反应分2轮进行。 第1轮PCR的2个反应分别产生2个含突变位点的上下游DNA