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测序知识概述 Invitrogen Proprietary Confidential 2 Content 普通测序及测序相关基础知识 普通测序生产流程介绍 困难模板测序相关知识 困难模板测序生产流程介绍 测序简单问题解答 Invitrogen Proprietary Confidential 3 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 什么是DNA以及DNA测序 又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。 ????DNA分子极为庞大(分子量一般至少在百万以上)，主要组成成分是腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸（简称A、T、C、G）。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。????除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。?? Invitrogen Proprietary Confidential 4 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA的结构 DNA共有四级结构 一级结构：由多个4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。 二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。 三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特定构象。如超螺旋等。 四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。 ——DNA测序就是测定DNA的一级结构 Invitrogen Proprietary Confidential 5 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。 Invitrogen Proprietary Confidential 6 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。 Invitrogen Proprietary Confidential 7 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA结构示意图——DNA的四级结构： DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。 Invitrogen Proprietary Confidential 8 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA测序原理 目前DNA测序的原理是Sanger双脱氧链末端终止法，简单来说，就是单引物扩增的PCR反应，但是将PCR反应体系中的dNTP换成了带有荧光标记的ddNTP和dNTP的混合物。 目前最普遍的DNA测序技术是采用四色荧光分别标记四种ddNTP. 一个样品的测序反应只需在同一反应体系中同时加入四种ddNTP. 产物无须分离即可在一个泳道中电泳. 序列的读取依靠检测器对不同荧光的区分.并需要通过软件系统的分析. 动画演示：/video/2005/43.htm 目前测序需要使用的仪器 A.PCR扩增仪 B.3730XL全自动荧光测序仪 Invitrogen Proprietary Confidential 9 普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求 测序分析软件 A. Sequencing Analysis 5.2，用于将测序原始数据转换为峰图文件 B.DNAStar,用于将测序得到的结果进行拼接 C.Chromas，用于显示DNA测序峰图文件 测序模板的要求 PCR产物直接测序 PCR已纯化产物：提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul (浓度大于50 ng/μl), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl（具体体积视客户反应数相应增加）。 未纯化PCR产物： 提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带, 同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl （具体体积视客户反应数相应增加）。 Invitrogen Proprietary Confidential 10 普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求 注意事项: PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡用胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开时，此时的PCR产物直接测序会出现双峰，这种情况建议把PCR产物克隆后测序。PCR已纯化产物请用水稀释不要用elution buffer。 PCR产物直接测序成功的另一