DNA浓度检测.doc

可以。DNA的碱基在260nm处有吸收。用紫外分光光度计测260nm处DNA分子的OD值，就能通过朗伯-比尔定律OD=εlc换算出浓度。式子里l是吸收光路的长度；c是浓度，单位一般用μg/ml；ε是吸光系数，双链DNA一般取0.02ml/(μg·cm)，单链DNA因为增色效应，ε要大一些，取0.05ml/(μg·cm)。 如果知道一个DNA片段的碱基数，还可以换算出DNA片段的物质的量浓度。 取1μDNA，用ddH2O水稀释到1ml，以1ml ddH2O为对照，紫外分光光度计测定OD260，OD280，OD260/OD280(都在 1.8左右之间，说明 DNA样品纯度较高),concentration。 另，基因组DNA1％的琼脂糖凝胶电泳检测均呈现完整清晰条带没有拖尾，说明 DNA 样品的完整性好，也可通过DNA marker 推算出DNA浓度。 目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。 原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链 寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值 （OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除 尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度 大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 试剂与仪器： 提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。 操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如 ODSUB260/SUB=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。4) 若ODSUB260/SUB/ODSUB280/SUB大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说 明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。 “1od=0.05ug/ul”这个说法很不严谨。按照我的理解，这句话的意思是：在光程为1cm的吸收池内，测得双链DNA的OD值为1时，DNA溶液的浓度为0.05μg/μL。 因为OD=εlc，这里OD=1，光程l通常都是1cm，双链DNA的吸收系数ε=0.02mL/(μg·cm)，那么浓度c=OD/(εl)=1/[0.02mL/(μg·cm)*1cm]=50μg/mL=0.05μg/μL。 楼主的测定在类似条件下，所以l=1cm，ε=0.02mL/(μg·cm)，而OD=0.45，所以浓度c=OD/(εl)=0.45/[0.02mL/(μg·cm)*1cm]=22.5μg/mL=0.0225μg/μL。 实验准备工作： 1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。 2 试剂配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。 0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取EDTA-Na2盐 187 g 加入约 800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可, 灭菌后于室温保存。 5.0 M NaCl: 称取NaCl 300 g, 加入蒸馏水约800 ml 于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止2~3分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml., 灭菌后于室温保存。 酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：可参考《分子克隆》亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ，蒸馏水50 ml，8-羟基喹咛0.05g 加入500 ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌，待酚达到水饱和后加入18 g Tris-Base，等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿：异戌醇（24：1），搅拌10~20分钟，静止约10分钟，除去上层水相后，装入棕色瓶，最后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保护液于4℃保存。 DNA Buffer的配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml 0.5 M EDTA (p