分子生物学10个主干实验)步骤.doc

《生物学实验四》实验操作步骤 2010年3月 实验一、细菌培养、细胞培养 大肠杆菌培养 (1)大肠杆菌是以DNA扩增或者以表达外源基因为目的最常用的基因工程菌。将含有目的基因的重组质粒或重组噬菌体导入大肠杆菌，并将该大肠杆菌在合适的培养基中培养、增殖，就可扩增目的基因。 (2)大肠杆菌培养包括固体和液体培养基的制作，平板培养、复壮培养和大量液体培养。根据培养目的分为DNA扩增培养和蛋白质的表达培养。 分子生物学实验使用的大肠杆菌主要是K12株的衍生菌株，用于重组的常用菌株有HB101、JM109、DH5α等,用于表达的常用菌株有BL21（DH3）等。 (3)大肠杆菌培养的操作大多在超净工作台内进行。超净工作台内常用的主要实验器具有：培养皿、培养试管、培养瓶、移液枪、白金接种环、接种棒、竹针、牙签、煤气灯或酒精灯等。超净工作台使用前要用70%酒精和紫外灯消毒。 (4)大肠杆菌的最适培养条件也是大多数霉菌和其它细菌的最适生长条件，为此，一切大肠杆菌培养用的试剂和器具必须灭菌。灭菌的方法有高压蒸气灭菌、干热灭菌、火焰灭菌、紫外线和酒精杀菌等。蒸气高压灭菌前，洗净的器具以及培养基等要用铝膜、牛皮纸等包裹好，灭菌条件为121℃，20min。 (5)平板制作：打开培养瓶塞，摇匀培养基，将培养瓶口在酒精灯上消毒，打开灭过菌的培养皿，分注培养基，培养基凝固后倒置培养皿，用灭菌口袋或牛皮纸包装后4℃冷却备用。 划线培养：将白金接种环在酒精灯上消毒，冷却后将白金接种环前端轻沾菌液后在固体平板培养基表面划线接种。倒置培养皿37℃培养一夜。 (6)液体培养：用灭菌牙签在平板培养基上挑选单菌落，将沾有单菌落的牙签放入2～3ml培养基的培养试管内，37℃、200～250 r/ min振荡培养一晚（8～16小时）。复壮后的菌株可进一步大量液体培养，用于质粒大量扩增或蛋白质表达。取2～3ml经复壮的菌液放入装有200～300ml培养基的锥形瓶内扩大培养，37℃、200～250 r/ min振荡培养至OD600为0.6左右。 昆虫细胞培养 详见《昆虫细胞培养》多媒体 实验二、昆虫病毒DNA的分离、纯化和鉴定 　1、2 ml病毒感染的培养细胞悬浊液 ↓ 8000 r/min 4℃ 10min，去上清 2、 加PBS漂洗混匀 ↓ 8000 r/min 4℃ 10min ，去上清 3、加250μl TE 悬浊 ↓ 4、加250μl Lysis　Buffer裂解细胞 ↓ 5、 加20μl Proteinase K（10mg/ml ） ↓ 50℃ 4h /37 ℃ 过夜 6、加3μl RNase A（10mg/ml ） ↓ 37℃ 30 min 7、 加等体积酚-氯仿 ↓ 12000 r/min 4℃/10min 取水相（剪枪头，烤平） 8、重复步骤7 9、水相加1/10体积 3mol/L NaAC（pH4.8） ↓ 10、加2倍体积的无水乙醇沉淀病毒DNA ↓-20℃，过夜 ↓12000 r/min 4℃/5min，去上清 11、70% 乙醇洗涤沉淀 ↓12000 r/min 4℃/5min 去上清 12、重复步骤11 13、适量TE 溶解 ↓ 14、电泳鉴定 实验三、PCR扩增昆虫杆状病毒基因及其产物的鉴定 1.PCR反应体系: TaqDNA 聚合酶 0.5μl 10×PCR Buffer 5μl dNTP 4μl Template(病毒基因组DNA) 1μl Primer1 1μl Primer2 1μl ddH2O 37.5μl —————————————————— Total 50 μl 2、PCR反应程序： 94 ℃ 3min 94 ℃