分子生物学究的内容.doc

一、 分子生物学研究的内容 a) 生物大分子的化学结构、大小、形状和三维结构，以及大分子之间的相互作用。 b) 生物大分子结构与功能的关系，以及生物学现象的分子生物学过程。 c) 生物大分子在细胞成分中的组织结构方式，活细胞在合成大分子时的物理化学过程。 d) 生物信息传递和代谢调节的分子生物学过程 二、生物化学与分子生物学的关系与区别 ? 分子生物学从分子水平研究生命现象，生物化学从分子水平研究生命化学现象，二者互相渗透。 ? 分子生物学主要研究核酸、蛋白质和其他大分子的结构和功能，以及其相互作用，着重遗传信息传递和代谢调节问题。生物化学代谢过程。 ? 分子生物学采用物理学、生物化学和遗传学相结合的方法，生物化学采用生物化学和化学的研究方法 三、分子生物学研究方法 ? X射线衍射法 ? 核磁共振技术 ? 基因表达谱研究技术 ? DNA芯片技术 ? 蛋白质谱研究技术 ? 蛋白质鉴定的数据库搜索法 第二章 遗传信息的传递 1．.中心法则的基本内容 2．核酸的化学组成 3．DNA的二级结构 4．DNA的超螺旋结构 二． 维持DNA双螺旋的力 1．氢键 ? GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构的重要特征之一，DNA的许多物理性质如变性、复性以及Tm值等都与此有关。 2.碱基堆集力 ： DNA同一条链相邻碱基之间的非特异性作用力，包括疏水作用力和范德华力。 氢键与碱基堆集力的协同作用 ? 已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。 ? 两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。 3.不稳定因素 ?磷酸基团间的静电斥力 ? 带负电荷的磷酸基的静电斥力，所以DNA需要保存在含 Na+ 生理盐条件 。 碱基分子内能 ? 物体的内能是物体内全部分子的分子动能与分子势能之和。 ? 温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，消弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使DNA的双螺旋结构受到破坏 三．变性(denaturation 概念：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程。 1.常用的变性方法 热变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 碱变性 pH11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 2.核酸变性程度的鉴定－紫外测定法： ? 原理： ? 嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处 ? 紫外光吸收值： 1 双链DNA A260=1.00 2 单链DNA A260=1.37 3 自由碱基 A260=1.60 3.熔解曲线与Tm值 缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到 0.1 ℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线 熔链温度Tm： OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 4.影响DNA Tm值大小的因素 ? G-C含量： Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41 (G+C)% GC%=（Tm-69.3）×2.44 ? 介质中的离子强度： ? DNA保存在高浓度的缓冲液中，如 1mol/LNaCl中。 5.DNA复性(renaturation) ? 变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为退火（annealing ? DNA的复性的条件有两个： （1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力； （2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高， ? 一般使用比Tm值低20－25℃ 。 复性的机制 ? 一般认为需要10－20个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构 6.复性的影响因子： ? 温度和时间：低于Tm值 25℃左右 (60-65℃) ? DNA浓度： ? DNA片段的大小： ? DNA顺序的复杂性； ? 反应溶液中的离子强度 四．DNA的超螺旋结构(三级结构 ? 绝大多数原核生物及病毒的完整DNA分子都是共价封闭环(covalently closed circle, CCC)分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋. ? 真核生物线状DNA与蛋白质结合以环状的形成存在。 ? 超螺