2016年基因导入真核细胞的方法(陈加祥)汇编.ppt

基因导入细胞的方法 ——转化和转染 陈加祥 PhD chenjiaxiang@ncu.edu.cn 一、大肠杆菌的转化 （一）大肠杆菌感受态细菌的制备试剂准备 （二）感受态细菌的制备步骤 （三）大肠杆菌的转化 （四）菌落的观察 二、细胞转染 （一）物理介导 （二）化学介导 （三）生物介导 三、细胞转染分类 四、影响转染效率的因素 五、转染效率的检测 一、大肠杆菌的转化 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。  在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内。 但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法（如电击法和CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。 宿主细菌 含Amp培养基 目前最常用的感受态细胞制备方法为CaCl2法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%（10%-30%）的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。 （一）大肠杆菌感受态细菌的制备试剂准备（氯化钙法） （1）制备感受态所需溶液的配制 ①液体LB 培养基配制 分别称取10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，溶于950 mL去离子水，用NaOH调pH至7.0，加去离子水定容至1000 mL，高温高压灭菌后，4 ℃保存。 ② 氯化钙转化试剂配制 0.1 mol/L CaCl2-MgCl2（感受态制备用）：80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2，去离子水配置，高温高压灭菌后，4 ℃保存。 （二）感受态细菌的制备步骤 1、从37 ℃培养16-20 h的新鲜平板中挑取一个DH5α单菌落（直径2-3 mm），转到含有100 mL LB培养基的1 L烧瓶中。于37 ℃剧烈振摇培养约3 h。 2、为得到有效转化，活细胞数不应超过10个/mL，可每隔20-30 min测量OD600值来监测培养物的生长情况，待菌液OD600达到0.35时开始收获细菌培养物。 3、在无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50 mL无菌管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0 ℃。 4、于4 ℃ 4100 rpm离心10 min回收细胞。倒出培养液，将管倒置1 min以使最后残留的培养液流尽。 5、每50 mL初始培养物用30 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液重悬，再于4 ℃以4100 rpm离心10 min，回收细胞。 6、弃上清，将管倒置1 min以使最后残留的液体流尽。 7、每50 mL初始培养物用2 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2悬浮，即制备成感受态细胞。可即刻使用，也可加甘油保护剂（30%）分装后-70 ℃保存。临用时冰上解冻。 （三）大肠杆菌的转化 　 1、从-70℃冰箱中取200 μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。　2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50 ng，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。 　3、42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 　 4、向管中加入1 ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。 5、将菌液4000 rpm离心5 min，剩100μl 液体混匀后，涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。 对照的设置： 　　 阴性对照：以同体积的无菌双蒸水代