5.6章分子生物学研究方法汇编.ppt

第五章 分子生物学研究方法 第一节、重组DNA技术发展史上的重大事件 第二节、DNA基本操作技术 第三节、基因克隆的主要载体系统 第四节、基因的分离与鉴定 基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。 基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 引 言 引 言 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。 基因工程技术区别于其他技术的根本特征 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就: 第一，解决了遗传的物质基础问题－－基因的分子载体是DNA; 第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题; 第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 他们还发现，EcoRl 酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。 此后，大量类似于EcoRl 但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 图D.5 限制性核酸内切酶EcoR I识别回文序列并将其切割产生粘性末端。 粘性末端 具平末端DNA片段之间的连接 图D.6 由限制酶和连接酶产生的重组DNA分子。 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 图D.9 分子克隆的一般过程（质粒大小未按比例画） 5·2 DNA基本操作技术 1、基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。 5·2·1 核酸的凝胶电泳 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 5·2 DNA基本操作技术 5·2·1 核酸的凝胶电泳 5·2 DNA基本操作技术 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。 2、琼脂糖凝胶电泳 5·2 DNA基本操作技术 2、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。 2、琼脂糖凝胶电泳 5·2 DNA基本操作技术 在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidium bromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05μg的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子