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PRIMER PRIMER 5.0 引物和探针的区别 引物：是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。引物一般是指比较短的，用来进行PCR扩增的比较短的寡核苷酸。 探针：放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针。探针是用来和PCR产物杂交，上面标记有荧光，用来检测PCR产物数量的。 常见错误说法 进行RT-PCR的探针管是由一对探针组成？是否还需要设计引物？ 引物有2个，探针只有一个？ RT-PCR引物和PCR引物摸板都是DNA？ 是由加拿大Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和Motif分析窗口。 Primer简介 File菜单中的Parameter命令可以对系统参数，PCR反应条件和程序打分系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓度，单价离子浓度，Mg离子浓度，Na盐浓度等。而打分系统是参照的右框公式： 根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。 序列编辑（Genetank），引物设计（Primer Design），酶切分析（Restriction Sites）和基序分析（Motif） 引物设计实例分析 PCR原理及步骤 PCR基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。 加热变性 退火—引物与靶序列结合 延伸 首个PCR循环的结束 PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。 确定目的基因序列 确定目的基因序列 确定目的基因序列 确定目的基因序列 确定目的基因序列 基因特点描述 最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑 显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示 显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％、简并性 有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测 显示的是对PCR扩增有影响的结构的位置，结构细节和稳定能 根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。 在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。 利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。 除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多种数据报告，主要通过Report菜单和Graph菜单中命令来实现。 将参与多序列比对的蛋白质序列中的任一条导入primer premier5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差数个核苷酸的序列群。 总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 利用primer premier5设计简并引物 密码子简并性 可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T） 引物设计原则 引物设计有3 条基本原则： (1)引物与模板的序列要紧密互补 (2)引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 (3)引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 引物设计应注意如下要点 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于DNA 聚合酶进行反应。另外太短易形成错配降低特异性。 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 Tm值：引物所对应模板位置