浅谈Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析.docVIP

浅谈Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析 论文对绝大多数的朋友们来说是必不可少的，为了让朋友们都能顺利的编写出所需的论文，论文频道小编专门编辑了“浅谈Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析”，希望可以助朋友们一臂之力! Abstract: Objective Analyses the structure of Monascus ruber 5031 lovastatin biosynthesis gene cluster. Methods Three pairs of degenerate PCR primers were designed matching the regions of lovastatin biosynthesis gene cluster in Aspergillus terreus,one of them is,5’primer: TTC GAT GCG GCC TTC TTC AAT,3’primer: ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC. Results A 745bp DNA sequence was amplified by PCR from Monascus ruber 5031 genomic DNA and the sequence is the same with Aspergillus terreus lovastatin biosynthesis gene. Conclusion There is similar sequence within the lovastatin biosynthesis gene cluster of Aspergillus terreus and Monascus Ruber. 　　Key words:Monascus ruber;Aspergillus terreus;lovastatin biosynthesis gene cluster; PCR 　　红曲霉(Monascus ruber )中产生的莫那可林K(monacolin K)即洛伐他汀(lovastatin)，是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一，并且对心绞痛患者和心肌梗死患者也有一定的治疗效果[1]。此外，它还可下调炎症相关转录因子的表达,从而有益于治疗动脉粥样硬化症[2]。近期研究表明,它可促进恶性甲状腺细胞凋亡[3]，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能[4]。 　　对参与洛伐他汀生物合成的聚酮合成酶的研究主要在土曲霉中进行[5-7]，土曲霉也是目前工业化生产洛伐他汀的主要菌种。Reeves和Vederas等研究了土曲霉(Aspergillus terreus)洛伐他汀的PKS基因结构，序列分析发现在克隆的64 kb DNA中有18个开放读框(ORF)，经序列对比分析确定了13个ORF的功能。其基因簇可分为洛伐他汀结构中九酮部分的合成酶基因(即LNKS)和二酮部分的合成酶基因(即LDKS)，LNKS也称为lovB，而LDKS含有的功能域有：lovC(烯酯酰还原酶)、lovD(转脂酶)、 ORF8(HMGCoA还原酶)、lovE(调节蛋白)、lovF(聚酮合成酶)、ORF13(调节蛋白)及细胞色素P450 加单氧酶等。 　　红曲霉中与合成洛伐他汀相关基因的结构的研究则较少，Chen等[8]于2005年8月发往Genebank的丛毛红曲霉的莫那可林K合成酶基因簇是第一个被发现的红曲霉合成洛伐他汀相关酶的基因簇。由于红曲霉中可产生洛伐他汀及多种有生理活性的物质，它又是传统的食品添加剂，所以通过分析研究红曲霉中洛伐他汀合成相关基因将有利于更好地开发利用红曲霉。本文分别以土曲霉的LNKS基因的KS区域(位于lovB基因区域内)、土曲LDKS基因簇中的 lovC(烯酯酰还原酶功能域)及lovE(调控蛋白功能域)基因为靶标设计了3对PCR引物，以这3组引物对产洛伐他汀的红色红曲霉菌的基因组DNA进行了PCR分析。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株和培养基 　　红曲菌种：中国工业微生物菌种保藏中心红色红曲霉Monascus ruber 5031。 　　斜面培养基：取50 g大米，洗净加水800 mL，煮成稀粥，冷却到60~65 ℃。将150 g麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀，放入55~60 ℃保温箱内糖化4 h，取出过滤。取250 mL加250 mL水，加2%的琼