乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒PCR-荧光探针一管法）.pdfVIP

乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒 （PCR-荧光探针“一管法”） 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 Beijing SinoMDgene Technology CO.,LTD. 技术支持部 预期用途 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种疾病， 主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病 毒感染者临床表现多样化，潜伏期较长，最常见的临床表现 有食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、乏力等症状，部分患者有 低热等症状。人感染HBV后，病毒持续6个月仍未被清除者可 发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝癌。 本产品采用实时荧光定量PCR扩增检测技术，用于定量检 测乙肝患者血清或血浆中的HBV DNA。 检测原理 本试剂盒采用微量核酸释放 剂快速裂解、释放血清或血浆样 本中的HBV DNA，利用针对HBV核 酸保守区设计的一对特异性引物 、一条特异性荧光探针，配以 PCR反应液，在荧光定量PCR仪上 ，应用实时荧光定量PCR检测技 术，通过荧光信号的变化实现 HBV DNA的定量检测。 产品 标准品 核 算 释 放 剂 反 应 液 酶促 荧 光 剂 储存条件：-20±5℃条件保存，避 免反复冻融 有效期：6个月 开封后冻融次数及稳定性要求：开 瓶后稳定保存不超过2个月，反复 冻融次数不超过3次。 适用样本及要求 适用样本类型：血清或血浆。 要求：EDTA抗凝或自凝血。 主要组成成份 病毒裂解 反应体系 标准品 实验操作 具体操作步骤 ? 一、试剂准备（在试剂准备区进行） 1、取出试剂盒，室温放置，各组分充分溶解后混匀并瞬时 离心备用； 2、配制反应体系：反应体系数=待测样本数+7（HBV阴性质控品 数1、HBV临界阳性质控品数1、HBV定量标准品(OT)Ⅰ～Ⅳ的数4）按 比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备成PCR- mix，颠倒混匀并瞬时离心后备用。 反应体系例如下： ? 二、样本处理（在样本处理区进行） 1、取3 ul核酸释放剂，加入PCR反应管中（过吸加样） 2、分别取待测样本、HBV阴性质控品、HBV临界阳性质控品 (OT)、HBV定量标准品(OT)Ⅰ~Ⅳ各3ul加入对应的PCR反应 管中（确认标本吸的量的准确，加的进去），并用移液器 在管底进行（有效）的吹打混匀5~10次 具体操作步骤 注：核酸释放剂过吸加样目的是为保证试剂加入量的准确 ? 二、样本处理（在样本处理区进行） 3、各PCR反应管中分别加入30ul(一滴)无菌石蜡油，然后 在PCR反应管口贴上封口膜(若无封口膜，可轻盖一层纸) 4、将PCR反应管放置在特定的96孔恒温金属浴或PCR仪中， 95℃，10min。 具体操作步骤 ? 三、PCR扩增（扩增在分析区进行） 1、将经过裂解处理后的PCR反应管从恒文金属浴或PCR仪中取 出，撕弃封口膜（或纸），在各管中按33ul/管的量，悬 空过吸加入前面所制备的PCR-mix到反应管内，盖上八连 管盖，确认封闭严后，必须颠倒混匀3-5次，瞬时离心10s 以上; 2、PCR扩增程序设置 具体操作步骤 结果分析 质量控制 1、HBV阴性质控品：无S型扩增曲线或无CT值显示； 2、HBV临界阳性质控品(OT)：呈S型扩增曲线且检测浓度介于1.0×102～ 2.0×103IU/ml； 3、四个HBV定量标准品(OT)：呈S型扩增曲线，且标准曲线相关系数 R2≥0.98； 4、以上要求需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进 行检测。 R2=0.99；扩增效率=0.99；斜率=-3.33；截距43.155 结果分析 ? 检验结果的解释 1、如果靶基因FAM通道没有出现S型扩增曲线，判为HBV DNA检测阴性。 2、如果靶基因FAM通道出现S型扩增曲线，判为HBV DNA检测阳性，检测 结果有如下解释： 1）测定值在0~500 IU/ml的样本报告为“低于试剂盒检出下限(500 IU/ml)”，即“500 IU/ml”。应结合其它临床诊断指标进行判断。 2）测定值在500~2.5×108 IU/ml之间的样本，直接报告所测定的数 值； 3）测定值大于2.5×108IU/ml的样本，可报告为“＞2.5×108 IU/ml”；若需精确定量，可根据结果将样本稀释至2.5×108 IU/ml以 下复测，并根据以下公式计算样本浓度，结果注明为可报告数值。 　　　　可报告数值(最终样本浓度)=稀释后浓度×稀释倍数 　　　　 稀释倍数=(样本量+稀释液量)/样本量 注意事项 2、核酸释放剂必须过吸加样垂直加入管底（保证加样量精确） 1、试剂避光保存（防止探针荧光标记降解） 3、正常加样加标本后移液器反复吹打5-10次混匀（关键）