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第七章 种子扩大培养 7.1 种子制备工艺 7.2 种子质量的控制措施 种子扩大培养是指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 目的：使发酵周期缩短，设备利用率提高 作为种子的准则是: 1)菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短 2)生理性状稳定 3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 4)无杂菌污染 5)保持稳定的生产能力。 7.1 种子制备工艺 种子制备的工艺流程如图所示，其过程大致可分为： 7.1.1 实验室种子制备 对于不产孢子的细菌，生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。然后再用茄子瓶固体斜面或摇瓶液体扩大培养。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。 （一）孢子的制备 1，细菌的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 培养温度一般为37?C。 细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 培养的温度一般为25~28?C。 培养时间一般为4~14天。 3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 培养温度一般为28?C。 培养时间为5~14天。 （二）液体种子制备 1，好氧培养： 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2-3天后，再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养3-5天即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。 7.1.2 生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 （1）种子罐级数的确定 种子罐的作用在于使孢子瓶中有限数量的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌丝体，接入发酵罐培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。 种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27?C,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27?C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 （2）接种龄与接种量 接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。 通常，接种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适。 接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 7.2 种子质量的控制 一、影响孢子质量的因素及控制 培