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内 容 提 纲 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 常规核酸定量方法 Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 传统 RT-PCR 半定量 PCR 实时荧光定量PCR 定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控 目的 对起始模板进行定量 优点 灵敏, 重复性, 动态范围宽, 高通量 原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成反比 什么是C(t)值 C(t)值与起始模板的关系 为什么要引入C(t)值 实时荧光定量 如何定量 常用的荧光试剂 SYBR Green ITM TaqMan? / TaqMan-MGB? Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux? primers ScorpionsTM Amplifluor Q-Zyme Others... 荧光定量PCR应用 特异核酸(基因)定性、定量 RNA (cDNA) 基因表达差异分析 基因芯片结果验证 DNA 病原体定性与定量 GMO (遗传改良组织)检测 序列特异性 等位基因分型, SNP 检测 应用之一:病原体检测与定量 应用之一:病原体检测与定量 应用之一:病原体检测与定量 两条探针分别针对不同等位基因 应用之四:GMO检测 应用之四:GMO检测抗除草剂的转基因大豆 应用之四:GMO检测 检测策略 抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆总量 荧光定量PCR仪的硬件条件 荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广,能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性. 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 Mx3000P 整体设计 Mx3000P 热循环系统 96 孔样品槽 半导体加热制冷 温度均一性: +/- 0.25°C 升降温速率: up to 2.5°C/sec 热循环系统 Mx3000P 光路系统 Mx3000P 光学系统 石英卤钨灯(350-750nm) 2 个滤镜轮 可选择的滤镜: Filter sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VIC, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy3 1 PMT(光电倍增管)检测器 350-700nm 发射光检测范围 扫描式检测设计 Mx3000P 扫描系统 整板扫描3.5s 滤镜轮旋转进行多通道扫描 激发光源的比较 Lasers: 光强高, 波长范围窄; 石英卤钨灯: 中等光强, 波长范围宽; LED: 光强低, 波长受限制。 Mx3000P 可用荧光染料 荧光滤镜系统 四通道设计,避免光谱重叠 荧光检测系统灵敏度比较示意图 PMT与CCD的检测原理 CCD与PMT检测区别 CCD与PMT检测结果均一性对比 Mx3000P均一性实验 利用FullVelocity? 技术提高PCR运行速度 最新的工程聚合酶 Archaeal (non-Taq) DNA polymerase 同样具有优越的: 灵敏度 特异性 可重复性 Mx3000P 软件 易学易用 各种数据分析方式:自动分析或者手动分析 支持荧光定量PCR的多种应用模式 多种应用模式 软件的结构 PCR程序设定 实时扩增数据 标 准 曲 线 相对定量Results Display 基因分型结果显示 结果文本显示 Text Report or raw data can be exported to Excel or a text file Brilliant? QRT-PCR and QPCR Reagents Master mixes and reagent kits for any fluorescent chemistry Compatible with sequence-specific probes SYBR Green kits Brilliant? SYBR? Green QPCR Reagents Brilliant? Probe-based QPCR Reagents 引物探针设计软件 独特优点 能高效设计双标记探针(Taqman,FRET探针,分子信标等) 优化的引物设计能适应不同的荧光定量PCR方法 能进行等位基因分析与多重定量PCR探针设计 有二级结构分析功能,能图形化显示各种位置与结构 内置BLAST连接 Fast Track QPCR 培训项目 优势: 快速有效的
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