2012级专业基础实验周实验内容.docVIP

课程名称：综合训练II(C)：3周 专业基础实验周实验内容 实验一 培养基中磷浓度对酿酒酵母胞内磷积累的影响 一、实验目的 1、巩固单因素试验设计方法用于考察磷浓度对胞内磷积累的影响； 2、巩固超净工作台、通风摇瓶柜、制冰机、超低温离心机、超声波细胞破碎仪和紫外分光光度计等常用仪器设备的使用方法； 3、学会微量元素溶液的配制； 4、掌握分批发酵及过程取样方法； 5、学会细胞破碎的方法； 6、掌握胞内物质的测定方法； 7、了解聚磷酸盐的一些基本知识。 二、实验过程 1、菌种：酿酒酵母 2、培养基（g/L） ⑴种子培养基（YEPD）：酵母膏10，胰蛋白胨20，葡萄糖20；pH 5.0。100，尿素2，KH2PO40.4、1.0和1.6，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.1，微量元素溶液1mL/L，pH值不调。 微量元素溶液(g/L)：KI 0.2，ZnSO4·7H2O 0.9，Na2S 0.3， SnCl2 0.1，NiCl 0.05，NaBr 0.05，MnSO4·H2O 2.5，CuSO4·5H2O 0.15，Co(NO3)2·6H2O 0.01，NaB4O7·10H2O 0.6，(NH4)6Mo2O24·9H2O 0.02，Al2(SO4)3 0.1，FeSO4·7H2O 5.56，Na2·EDTA·2H2O 7.46。 3、种子培养：在新鲜斜面上挑取1~2环接种于YEPD液体培养基中， 30℃、150 r/min全温摇瓶柜中培养 h左右，观察种子液的色泽、气味与形态等。接种于中，30 ℃、150 r/min全温摇瓶柜中培养h。（μg/mL）KH2PO4 0.4 g/L 0 h 48 h 60 h 72 h KH2PO4 1.0 g/L 0 h 48 h 60 h 72 h KH2PO4 1.6 g/L 0 h 48 h 60 h 72 h 2、实验结果分析 要求：从磷水平与发酵时间两个角度，说明葡萄糖消耗及胞内外酒精、磷的生成有何规律？ 补充：钼酸铵分光光度法测磷（GB11893-89） 1、原理 在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵反应生成物黄色的磷钼杂多酸，然后用抗坏血酸使之还原成蓝色络合物即磷钼蓝，在710 nm最大吸收波长处用分光光度法测定。 2、试剂 硫酸：（1+1）溶液。 磷酸二氢钾、甲酸和乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）：AR。 抗坏血酸溶液：称取10 g抗坏血尿酸（精确至0.5 g）、0.2 g乙二胺四乙酸二钠（精确至0.01 g）溶于200 mL水中，加入8 mL甲酸混匀。移入500 mL容量瓶中定容，倒入棕色试剂瓶中，贴上标签。（有效期一个月） 钼酸铵溶液：称取26 g钼酸铵（精确至0.5 g）、1 g酒石酸锑钾（精确至0.01 g）溶于400 mL去离子水中，加入460 mL（1+1）硫酸溶液，混匀，冷却后用去离子水定容至1 L容量瓶中，倒入棕色试剂瓶中，贴上标签。（有效期两个月） 磷标准贮备液（1 mL含有0.5 mg PO43-）：称取0.7165 g已在100~105 ℃干燥恒重过的磷酸氢二钾（精确至0.0002 g）溶于约500 mL高纯水中，定量转移至1 L比色管中，用高纯水稀释至刻度线，摇匀，备用。 磷标准操作溶液（1 mL含有0.02 mg PO43-）：取20.00 mL磷标准贮备液于500 mL容量瓶中，用高纯水稀释至刻度，摇匀，备用。 3、仪器、设备 紫外分光光度计、20mL比色管、1 cm比色皿、125 mL三角瓶和电炉。 4、分析步骤 ⑴绘制工作曲线：取6只50 mL比色管，分别加入磷标准操作溶液0 、1、3、5、6、7、9 mL。向各管中加入25 mL高纯水、2 mL钼酸铵溶液、3 mL抗坏血酸，用水稀释至刻度，摇匀，室温下放置10 min。使用1 cm比色皿于710 nm波长处，以试剂空白溶液为参比，测定吸光度。以磷含量为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 ⑵正磷酸盐含量制定：分别取发酵清液、细胞内萃取液及其水解液10 mL（V）于500 mL容量瓶中，加入2 mL钼酸铵溶液、3 mL抗坏血酸，用水稀释至刻度，摇匀，室温下放置10 min。使用1 cm比色皿于710 nm波长处，以不加实验溶液的空白调零测吸光度，从工作曲线上查得与吸光度对应的PO43-的微克数（m）。 ⑶结果计算：PO43-（mg/L）=m/V 取两次平等测定结果的算术平均值为测定结果，两次差值不大于0.30 mg/L。 实验二 不同碳源对人参发根培养的影响 一、实验目的 1、