杯碟法检测方法090626—新.docVIP

杯碟法检测青霉素酶的方法（试行） 1.适用范围 本方法适用于原料奶、灭菌乳、乳饮料中青霉素酶的检测。 2.实验原理 青霉素酶能够破坏青霉素对藤黄微球菌的抑制作用，而舒巴坦能特异性地抑制青霉素酶的这种作用，在样品中先后加入适量的舒巴坦和青霉素，采用杯碟法通过测定抑菌圈大小差异来检测样品中的青霉素酶。 酶活单位（Active Unit）：在室温（25℃）下，1min分解1μmol的青霉素G所需的酶量为一个单位，即1IU。 3.试剂与材料 除另有规定外，所有试剂为分析纯，水为GB/T6682-2008规定的三级水。 3.1 菌种：藤黄微球菌（Micrococcus Luteus）,菌种号CMCC（B）28001。 3.2 青霉素酶标准品：纯度≥90%，酶活1200IU/mg（≥1000万青霉素效价单位），4℃保存。 3.3 舒巴坦标准品：纯度89.2%，4℃保存。 3.4 青霉素G：色谱级，纯度97%（分析纯需适当增加标准工作溶液浓度），密封避光，防潮，4℃保存。 3.5 磷酸二氢钾（KH2PO4）：纯度99.5%。 3.6 磷酸氢二钾（K2HPO4）：纯度98%。 3.7 氯化钠（NaCL）：纯度99.5%。 3.8 磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）：取8g磷酸二氢钾（3.5）和2g磷酸氢二钾（3.6），用1000ml水溶解，121℃高压灭菌15min。 3.9 生理盐水：称取8.5g氯化钠（3.7），溶解于1000ml水中，121℃高压灭菌15min。 3.10 青霉素酶标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）青霉素酶标准品（3.2）用生理盐水（3.9）溶解并稀释，配成酶活力为1000IU/ml的标准储备溶液，4℃保存。可使用1个月。 3.11 青霉素酶标准工作液：用生理盐水（3.9）将青霉素酶标准储备溶液（3.10）稀释配制成酶活力为1IU/ml的标准工作溶液，需当天配制使用。 3.12 舒巴坦标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）舒巴坦标准品（3.3），用磷酸盐缓冲液（3.8）溶解并定容为10mg/ml。4℃保存。可使用1-2个月。 3.13 舒巴坦标准工作溶液：用磷酸盐缓冲溶液（3.8）将舒巴坦标准储备溶液（3.12）稀释配制成浓度为1mg/ml，需当天配制使用。 3.14 青霉素G标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）青霉素G（3.4），用磷酸盐缓冲溶液（3.8）溶解并定容为1mg/ml,4℃棕色瓶中保存，可使用1-2个月。 3.15 青霉素G标准工作液：取青霉素G标准储备液（3.14），用磷酸盐缓冲液（3.8）稀释，配制成浓度为10μg/ml，4℃保存。可使用2-3天。 3.16 空白奶粉：脱脂奶粉 3.17 灭菌脱脂乳：使用脱脂奶粉（3.16）按GB/T4789.27-2008中4.2执行（10g奶粉+90ml水，113℃灭菌20min）。 3.18 菌种培养基：LB营养琼脂 3.19 抗生素Ⅰ号培养基 4.仪器与设备 4.1 天平：精确到0.001g 4.2 冰箱：4℃ 4.3 恒温培养箱：36℃±1℃ 4.4 恒温水浴锅：55℃±1℃ 4.5 恒温干燥箱 4.6 高压灭菌锅 4.7 抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺（精确到0.1mm） 4.8 旋涡混匀器 4.9 移液枪：20-200μl、100-1000μl、1000-5000μl 4.10培养皿：内径90±0.5mm，皿底平整光滑，厚薄均匀无凹凸现象。 4.11牛津杯：不锈钢管，外径（7.8±0.1mm）,内径（6.0±0.1mm），高度（10.0±0.1mm）。 4.12陶瓦盖：内径110mm，外径116mm，高度26mm。 5.检测步骤 5.1试样制备 5.1.1液体奶：取奶样25g，混合均匀，待处理。 5.1.2酸奶：取酸乳样品25g，经生理盐水1：1稀释，混合均匀，待处理。 5.1.3 阴性对照样品：灭菌脱脂乳 5.1.4阳性对照样品：移取青霉素酶标准工作液加入到灭菌脱脂乳中，混合均匀配制成酶活力为0.1IU/ml的阳性对照样品，4℃保存。可使用2-3天。 5.2试样处理 5.2.1取试样900μl分别放入A、B、C、D四个2ml离心管中，加入以下配置（加样顺序按试剂排列顺序）： A：加50μl舒巴坦标准工作溶液，再加入50μl青霉素G标准工作溶液。 B：加50μl舒巴坦标准工作溶液，再加入50μl磷酸盐缓冲液。 C：加100μl磷酸盐缓冲液。 D：加50μl青霉素G标准工作溶液，再加入50μl磷酸盐缓冲液。 将上述混合液用涡旋混匀器充分振荡混匀，室温放置1小时后检测。 同时做阴性对照和阳性对照样品各一组。 5.3菌悬液的制备及用量 将菌种接种于菌种培养基斜面试管中（工作菌株正常使用传代数为3-10代，一般可使用1-2个月），36±1℃培养