基因操作原理 基操复习要点.docxVIP

大肠杆菌受体优点：1、易转化；2、可使用多种易操作的载体，宿主范围较大缺点：1、缺少辅助功能的生化途径，这些有利于表型功能的研究，如芳香族的降解、抗生素的合成、致病性、孢子形成等在新宿主中克隆有3个先决条件：具有将目的基因导入受体的方法：转化、接合、电穿孔；目的基因在受体菌中能稳定存在：以复制子的形式或整合到基因组中、前质粒中；目的基因在表达时能被检测到目的基因的导入其他菌的转化特点：1、自然发生，转化能力是一个短暂现象 2、在一些菌中，转化是独立序列进行的 3、自然转化机制涉及到DNA双螺旋的断裂，并降解其中一条单链，使得另外一条能够进入宿主 方法：感受态细胞的转化、原生质体的转化、电穿孔、质粒援救转化目的基因的稳定重组DNA分子通常以CCC的形式存在于质粒中，而后者主要取决于质粒的宿主范围（编码复制过程的蛋白质的数量），如S.aureus 的质粒和RSF1010均可在G+或G-中复制为了扩大宿主范围，通用方法为形成杂交质粒。如大肠的pBR322和S.aureus或B.subtilis 的pC194、pUB110的混合穿梭质粒。它的特点，人工构建、两种不同复制起点和选择标记，能在两种类群宿主中存在并复制。它的优点是大肠能够成为克隆的中间宿主重组DNA的综合重组质粒进入宿主细胞后，通常会有以下结果：以稳定的质粒形式存在丢失通常整合到基因组中同源重组：代替经常是双链交换例子：构建了一个集合质粒：neomycin抗性基因和B.subtilis的amyE基因插入到pBR322中，将这个质粒转入B.subtilis，该质粒不能复制，但如果筛选为抗性而做，那么质粒的集合就在amyE处进行。这一方法可用于构建单拷贝的外源基因的重组子。G-中的clone经常以大肠作为中间体，因此所需质粒必须能在大肠中复制。选择范围在穿梭质粒或是宽松型宿主范围的质粒外源DNA导入宿主细胞需要克服的难题：1、检测位置依赖于基因表达，缺少精确的转录和翻译；2、外源基因基因进入后常丢失解决方式：使它们附加一个合适的复制子，通常是克隆载体酵母中克隆1、宿主特点：优点：清晰的遗传学背景、全基因序列；易于扩增无毒性；可用于工业发酵缺点：产乙醇不能用于长期发酵；缺乏分泌系统；过分糖基化2、导入外源基因的方法： 原生质体转化（蜗牛酶法）；电穿孔；接合转移3、酵母中的载体 质粒：1）YIp，整合型质粒，最稳定,难以从染色体上切下来； 2）YEp：2u质粒附加体型质粒，易提取，易丢失，高拷贝，能在大肠和酵母中复制，含STB区域保持质粒稳定； 3）YRp复制型，能在大肠和酵母中复制，拷贝低，不稳定（缺少STB），可当穿梭载体使用，易提取,易丢失； 4）YCp着丝粒型，分裂时分配均等，低拷贝 YAC：酵母人工构建染色体，容量大 反转录病毒类似载体：Ty，转座子类型载体4、筛选方式 1）营养标记筛选：his3、leu2、trp1、ura3 2）正筛选：ura3、lys25、表达和应用的影响因素PCR专区预变性、解链、退火、延伸（3个循环之后，获得2个目的基因分子，成2的次幂增加2n-2，n为循环次数）引物、模板、dNTP、Taq 酶重组子筛选方法遗传检测方法：resistance marker， 半乳糖苷酶显色反应（蓝白筛）， 插入序列表型特征；免疫化学方法：免疫沉淀（高表达、外分泌克隆筛选，在含抗体的平板中）、放射性抗体检测（噬菌斑作抗原、免疫动物作抗体，利用抗原抗体反应通过放射自显影选出重组体，适用于融合蛋白表达的基因和无表型特征的克隆，但必须是表达载体且具有同位素）核酸杂交：探针、分子杂交基因工程一般过程：切、连、转、检基因工程的概念：在体外对不同来源的DNA分子进行重新组合，并使之在宿主细胞中实现增值和表达的遗传操作。1973年——基因工程诞生1977年——首个真核基因在原核细胞中得到表达切：目的基因和载体宿主限制和修饰系统限制的目的：便于宿主识别自我和非自我，限制酶识别特定序列进行固定或者随机切割。修饰的目的：将外源DNA修饰成自我，保护外源DNA不被降解。实验：用感染E.coli K的噬菌体去感染E.coli C，则形成的噬菌斑效率低；反之，用感染E.coli C的噬菌体去感染E.coli K，形成的噬菌斑效率也低。只有再次感染相同种类的噬菌体后，形成的噬菌斑效率高。限制酶的分类：根据限制和修饰系统可将限制酶分为3类：其中限制酶2的优势在于：1）识别序列和切割序列固定；2）修饰和限制功能相分离，一种酶只起一种作用；3）不需要ATP或S腺苷甲硫氨酸等辅基的帮助