2_2-D 样品制备.pdf

1 / GE / 2-D 样品制备 This is not merely a start. Outline ? 样品制备概述 ? 需考虑的因素及示例 ? 相关产品 2 2-D DIGE Training Course 基于2D的科学研究 3 Scientific Project 研究背景调查 差异图像分析 样品制备 实验设计 预实验 正式实验 蛋白鉴定 功能分析 验证实验 2-D DIGE Training Course 蛋白质样品的特征 ? 复杂，含盐或其他污染物 ? 易被蛋白酶降解 ? 动态范围宽（106） ? 溶解性不均一（疏水性/亲水性） ? 分子量、等电点的范围宽(10-500KDa， pH2-14) 4 2-D DIGE Training Course 样品制备的基本要求 ? 高灵敏度和分辨率 ? 宽动态范围 ? 避免蛋白酶降解 ? 尽量少的操作步骤减少污染和损失 5 2-D DIGE Training Course 需考虑的因素及示例 2 / GE / 需考虑的因素 ?样品的来源，状态 ?样品中是否有高丰度蛋白质，复杂程度？是否需要预分离？ 是否存在干扰物质? 分离质量 vs. 总蛋白 ?参考一些相似样品制备的文献 ?使用高质量的试剂和水 7 2-D DIGE Training Course 2-D 样品制备基本流程 8 保护蛋白不被蛋白酶降解 细胞破碎 ? 液氮研磨 ? 超声破碎 ? 匀浆 ? 裂解液裂解 蛋白沉淀 ? TCA ? 丙酮 ? TCA+丙酮 ? Clean up kit 蛋白溶解 ? 尿素 ? 硫脲 ? 去污剂 ? 两性电解质 干扰物去除 ? 核酸 ? 脂类 ? 盐类 ? 色素 ? 缓冲液 ? 带电小分子 ? 不溶物 2-D DIGE Training Course 细胞破碎方法 ?冻融或渗透裂解 ?去污剂裂解 ?超声 ?酶裂解 ?研磨 ?机械匀浆 9 2-D DIGE Training Course 样品预分级方法 ?通过溶解性不同 通过逐渐增强的溶解剂进行顺序提取 ?通过色谱法 如，疏水层析色谱 ?通过离心分离亚细胞组分 如线粒体、核、胞浆 ?通过亲和法 复合物的免疫沉淀或选择性去除高丰度蛋白 10 2-D DIGE Training Course 核酸去除 ?DNase I 和 RNase A 经常被使用 (add 0.1x vol of 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A in 50 mM MgCl2) ?核酸酶在8 M尿素中会失活 ?DNase I 会出现在2-D 图谱中. (pI ~5, MW ~30 kDa) ?Benzonase (混合型核酸内切酶，同时具有DNase 与 RNase 活 性) 也常被使用。 ?超声的效果很好，但需要掌握时间与强度 11 2-D DIGE Training Course DNA酶作用效果 12 E. coli 提取蛋白 7 cm pH 3-10 NL + DNase - DNase 2-D DIGE Training Course 3 / GE / 蛋白沉淀 ? 硫酸铵沉淀 ? TCA 沉淀 ? 丙酮和/或乙醇沉淀 ? TCA 加丙酮沉淀 ? 效率不高，后续需要 脱盐 ? 有时重新溶解比较困 难 ? 去除脂类和去污剂效 果较好 ，但很多蛋白 可能无法沉淀出来 ? 较两者单独使用效果 好，尤其对碱性蛋白 13 2-D DIGE Training Course 没有经过丙酮沉淀的样品 经过丙酮沉淀的样品 沉淀的效果 14 2-D DIGE Training Course 沉淀的效果 大鼠肝脏提取蛋白 4 % SDS, 40 mM Tris base 用2-D Clean-Up Kit处理 15 pH 4-7 pH 4-7 未处理 2-D DIGE Training Course 蛋白溶解 ?尿素 (8-9.8 M) , or 7 M 尿素 / 2 M 硫脲 ?去污剂 (SDS , NP-40, CHAPS,…) ?还原剂 (DTT, TBP) ?载体两性电解质 (0.8 % IPG buffer) 超声可帮助溶解 尿素需要在样品加热前加入