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生物分析化学作业 姓名： 学号： 培养单位:  超高效液相色谱-质谱联用同时检测婴儿奶粉中的牛α-乳白蛋白和β-球蛋白含量 Analytica Chimica Acta667 (2010) 96–102 摘要 作者开发了一种能够同时检测出牛α-乳白蛋白（α-La）和β-球蛋白(β-Lg)含量的可靠超高效液相色谱法。与之前的方法相比，此法在选区监测模式下与质谱联用，分析速度快，检测限低。为了得到目标分析最好的分辨率，此法采用包含0.1%三氟醋酸(TFA)水溶液（A）和0.1%三氟醋酸（TFA）的乙腈（B）的线性梯度移动相和UPLC BEH300 C18色谱柱（150mm×2.1mm,1.7μm）。精确定量需要使用人体α-乳白蛋白作为内标。鉴于其线性度（R2≥0.9991），灵敏度（定量限，0.15–0.19μgmL?1），恢复率（94.0–98.7%），精确度（相对标准差≤11.1%），可重复性（相对标准差≤5.7%），此方法普遍有效。研究显示这是一种在生物药品中同步检测主要乳清蛋白的可行方法。目前有效的方法已被成功应用于婴儿奶粉中的蛋白质检测。 前言 由于其独特的生物化学营养功能性质，乳清蛋白是非常重要的食品蛋白质，已经被用作运动员的膳食补充和用于食品工业添加剂。婴儿奶粉富含乳清蛋白，是非常重要的市场，在过去的二十年里被广泛开发。因为它们的营养和生物活性，包括α-白蛋白在内的各种各样的作料已经或是提议作为添加剂加入到婴儿奶粉中，来更好地模拟人乳的成分。乳清蛋白作为婴儿奶粉的主要成分的一个主要问题是，β-球蛋白的存在。这种在母乳中存在的蛋白被报道会引起婴儿的过敏反应，从而限制了牛乳用作婴儿牛奶的原材料。然而，一些商业婴儿奶粉通常都含有大量β-球蛋白。另一个问题产生自天然形式的乳清蛋白的质量控制。尽管人们已经知道奶制品的营养和功能直接与蛋白质的自然态相关，但是很难控制奶制品中的成分。不同的加工过程会导致不同的蛋白质改动，从而反过来影响原生态乳清蛋白的品质。所以，不同厂家的相同产品的生物活性也不同。因此，为了保证婴儿奶粉的营养价值，发展α-La和β-Lg定性定量分析的品质控制方法是个十分重要的问题。 ??于毛细电泳CE，凝胶电泳GE，液相色谱LC和免疫化学方法的各种各样的分析技术被用作乳清蛋白分析。CE只在蛋白质微量分析中有效，分析时间相对较短，但是重现性不好。尽管CE也能同时检测多个样品，但是比较耗时，精确度低，需要离线检测，限制其应用。免疫化学分析具有高灵敏度，但是制备新抗原的抗体是个冗长的过程。乳清蛋白分析最常用的方法是液相色谱与不同方法联系技术。然而，传统的HPLC法通常使用5μm颗粒填充的色谱柱，会消耗很多时间分开目标化合物。为了解决这个缺点，当前人么开发了超高液相色谱UHPLC法。将粒径5μm（HPLC）降低到1.7μm（UHPLC），从而提高了色谱的分辨率和灵敏度。质谱检测的引入大大提高了蛋白质分析技术，因为其特殊的选择性和提供高度结构特异性信息。越来越多的实验方法证明LC-MS是种检测蛋白质的强大工具。尽管此种分析法在纯溶液和基质中的的离子化效率差异会影响其精确度。这个问题可以通过以下两种途径解决：一、采用外部基质校正；二、在样品中加入内标来校正制样和离子化效应所产生的复苏性损失。 用LC-MS定量蛋白质可以再核苷酸水平（经过蛋白质消化后的信号核苷酸分析）或蛋白质水平（未经接触的蛋白质分析）。描述了利用同位素标记合成类似物作为IS通过分析胰蛋白酶信号核苷酸进行蛋白质定量的方法。这种方法的优势是：检测限低和同位素标记核苷酸易于获得。缺点是IS的表现也许会和在消化前过程中的未经接触的蛋白质很不相同。这会导致分析和IS的不同损失，并接着影响方法的精确度。蛋白质水平分析直接进行分析，避免了潜在的会产生问题的消化步骤，但是合适的IS得获得是是一个主要问题。理论上，理想的IS是同位素标记的所分析蛋白质的类似物，它在整个样品制备过程中的表现和被分析蛋白质相似。然而获得这样的IS需要复杂的制备过程。替代方法是采用与所分析蛋白质序列相似的物种变体（例如，不同物种的同一蛋白质）作为IS。此方法采用山羊β-Lg和麋羚β-Lg作为检察奶制品中牛β-Lg的IS。 采用LC-MS在生物基体中定量分析蛋白质的关键问题是不同婴儿奶粉中的乳清蛋白含量显著不同所产生的灵敏度问题。在以前的研究中，研究者采用完全扫描模式下的质量分析来获得蛋白质的完全电荷分布（CDs）。这种方法可以避免潜在的精确度或重现性问题。但是，灵敏度达不到同时检测不同婴儿奶粉中主要乳清蛋白质的要求。 基于这些考虑，作者在实验室中发展了一种