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实验一 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的含量（p24） 一、目的要求? 掌握考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质含量原理和方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质─染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm。且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。 三、材料、试剂与器具 ?（一）、试剂： 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。??终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 2．待测蛋白质溶液。 人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。 （二）、器材： 1、试管1.5×15cm（×6）和试管架。 2、移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）； 3、可见光分光光度计。 （三）、标准曲线制作： 试管编号012345未知200ug/ml标准蛋白（ml）0.00.20.40.60.81.00.15mol/L NaCl （ml）21.81.61.41.21.0考马斯亮蓝试剂 （ml）666666摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色蛋白质浓度（ug/ml）0510152025A595nm 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（ ），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）利用标准曲线查出回归方程。 2）用公式计算回归方程。 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0. 5之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 玻璃仪器要洗涤干净。 取量要准确。 玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 对照：用被测物质以外的物质作空白对照。 在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 实验二、　紫外吸收法测定核酸的含量 一、 目的 1、熟悉紫外分光光度计