酶联免疫吸附试验(ELISA)论述.ppt

实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 实验内容： 间接法测定溶血素 ——定性检测 实验材料 脱纤维绵羊红细胞—— 抗原 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）—— 待测兔血清 HRP标记羊抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40μL 酶标板，酶标仪 实验方法 实验方法 预期结果 阳性：显色为黄色 阴性：无色 注意事项 洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。 2.补体结合反应（Complement fixation Test, CFT） 概念： 补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。 原理： 补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。 材料： 抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：56℃，30min 补体：豚鼠血清 2%绵羊红细胞 溶血素 方法： 预期结果： 注意事项： 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。 各种试剂的吸管不可混用。 * 在上面两次试验中，应用抗原抗体特异性结合反应的原理，进行了凝集反应、沉淀反应的等经典的血清学反应。 然而，这些实验在结果分析时，常常采用肉眼观察的方法，进行定性、半定量的检测，存在主观因素的影响，而且难以进行微量抗原、抗体的检测。因此，人们希望引入其他的技术，在不影响抗原抗体反应的前提下，提高检测的灵敏度和准确性。 免疫标记技术的兴起，使得这种想法得以实现。 随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。  前面所讲述的凝集反应、沉淀反应以及今天要进行的补体结合反应均属于经典抗原抗体反应的范畴，这些反应的原理非常简单，就是抗原抗体的特异性结合，反应结果可以通过肉眼来直接观察凝集团块、沉淀线或者溶血现象。然而，这些经典方法的缺点是对于所检测抗原抗体的浓度要求比较高，敏感性较低，当抗原抗体量较低时，很难出现肉眼可见的上述现象。此外，用肉眼观察结果具有一定的主观性，不同的观测者可能判定的结果不一致，比如试管凝集反应凝集程度的判定。 因此，需要一种辅助性手段来提高抗原抗体反应的敏感度和标准化，免疫标记技术的发明解决了这一问题。 酶反应的最大特点是：高效性，一个酶分子可以结合多个底物分子，发挥酶解作用。因此，将酶连接在实验所需的抗体中，可以对抗原抗体反应有一种放大的效应，具有高灵敏度的特点 酶联免疫吸附试验属于免疫酶技术的一种 根据标记对象和检测对象的不同，可以分为多种类型，以其中一种来介绍这种方法的基本原理i： 首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分。 在吸附有抗原的酶标