第05章代谢物酶法技术答辩.pptVIP

　　利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 　　酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。 酶循环法 (3) 使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。 检测指示系统： ①循环前、后用速率法测定NADH(340 nm) 的变化。②检测产物H2O2可通过Trinder 反应比色测定。 产物循环－氧化酶－脱氢酶系统 产物循环－氧化酶－脱氢酶系统 甘油浓度测定 通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计的量决定于t 和每min循环次数。 底物循环－脱氢酶－辅酶系统 用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。用395 nm ～415 nm 波长测定反应中氧化型thio-NAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。 循环反应条件： 酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力。 溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。 thio-NAD+ 和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。 底物循环－脱氢酶－辅酶系统 血淸胆汁酸测定 　　胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。 氨循环－合成酶－脱氢酶系统 NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。 酶循环法具有的特点 灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定 酶活性恢复法 很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。 其他酶法 (4) 异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法 异柠檬酸+ NADP+ α-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+ 用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。 酶活性恢复法应用举例 丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 α-半乳糖苷酶法测定钠离子 淀粉酶法测定氯离子 超氧化物歧化酶法测定铜离子 碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 激活和抑制法 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37℃水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。 有机磷的酶法测定 根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。 另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。 返回章目录 试剂酶质量 试剂酶概念 试剂酶特征 试剂酶纯度 酶法设计要求 酶法设计共性要求 平衡法设计的要求 速率法设计的要求 代谢物酶法分析的设计要求 3 试剂酶来源 试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。 试剂酶的质量要求 (1) 试剂酶的概念 主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。 不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。 试剂酶的来源和理化特征 试剂酶的质量要求 (1) 不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。 纯度主要指标 ①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。②杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。 试剂酶的质量要求 (1) 试剂酶的纯度要求 表5