分子生物学实验答案.doc

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。克隆载体一般是原核细菌 将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接 在导入原核细菌内 质粒会在原核细菌内大量复制 形成大量的基因克隆 被克隆的基因不一定会表达 但一定被大量复制而表达载体是一些用于工程生产的细菌 他们被导入目标基因 这些目标基因会在此类细菌中得到表达 生产出我们需要的产物 导入的基因是有克隆载体产出的. 酶切片断的回收与连接时有哪些注意事项 胶回收胶回收胶回收胶回收DNA注意事项注意事项注意事项注意事项 ①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们 就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。 ②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。 ③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。 ④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完 全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合 DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。 ⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。 ⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收 效率低的解决方案。 ⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书 提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。 ⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议 即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。 ⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久， 使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。 双酶切连接反应的注意要点 双酶切 1、 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的则必须先切否则就可能造成酶切失败。 2、 回收PCR产物回收的PCR产物片段=110 一般取前者0.03pmol后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNAX pmoles×长度bp×650/ 1,000,000 注长度bp×650是该双链DNA的分子量所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。 3、 双酶切时间及其体系需要强调的是很多人建议酶切过夜其实完全没有必要一般酶切3个小时对于PCR产物可以过夜酶切效果会很好。酶切体系不宜过大会影响质粒和酶的碰撞机会效果降低质粒量不应该超过酶切要求的最大量否则酶切不完全酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。 4、 两种酶切的条件不同时分别进行两次酶切切完一个纯化后再切温度要求不同先酶切低温要求的再酶切高温要求的若盐浓度要求不同先酶切低盐浓度要求的再酶切高盐浓度要求的。 5、 若质粒是在TE中保存的TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合影响酶切效果可放大酶切体积或重新浓缩质粒。 6、 限制酶的选择非常重要尽量选择粘端酶切和那些酶切