腺相关病毒生产流程.docx

腺相关病毒生产流程腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下文分解？怎么可能，下面就是腺相关病毒生产流程。?腺相关病毒重组克隆载体构建1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF （注：维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。腺相关病毒载体图谱（维真生物）细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入 50ml 离心管中， 800g 离心5min。2) 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。3) 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和日期。5) 放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。细胞复苏流程1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热至 37℃。2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。4) 摇晃均匀，放培养箱培养。5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中 DMSO 对细胞的毒害作用。也可在第 3步中 800g 离心 5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中）。?细胞培养流程（以 10cm 细胞培养皿，传代为例）1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。2) 灭菌期间，DMEM 培养基(含 10%FBS，1%青链霉素混合液)、PBS 以及 0.25%胰酶在 37℃水浴锅中预热。3) 取汇合度接近 100%活性好的的 HEK293T 细胞，吸弃培养盘中培养基，加约 5ml，1×PBS，摇晃几下，吸弃PBS。（加 PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的 FBS，以提高胰酶的消化效率）4) 加 1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约 1min，室温低时可放置于培养箱中消化。消化时间不宜过长，否则影响细胞再次贴壁效率和活性。5) 加入约 5ml 的预热的培养基。6) 用移液管吹打均匀，按照 1:3 比例传代。各洗 2ml 培养基至新的 10cm 皿中，再加入8ml 预热的 DMEM 培养基。（吹打过程中不可用力过大，否则会吹破细胞）。注意：传代盘数较多时，要先将预热的 DMEM 培养基加入到 10cm 皿中，再加入含细胞的培养基，以避免细胞分布不均。放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基，使细胞均匀分散于培养基中。细胞培养条件为 5%-7%CO2 浓度，37℃，培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度。细胞传盘以及分 6 孔板，24 孔板，96 孔板分细胞都经过上述流程，只是细胞数与分的比例不同，具体情况具体操作。?AAV 病毒包装以 10cm 细胞培养皿为例第一天: 聚合度90%以上的 HEK293T 细胞按 1：3 比例传盘（每盘大约 2.5? x 10E6），培养基 Hyclone 高糖 DMEM 培养基（含 10%FBS）。第二天: 转质粒前 1-2h 左右，换成无血清培养基（所有血清型 AAV），用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒（需用酚氯仿提取的质粒）转入HEK293T 中。第三天：质粒转化 24h 后，换新的无血清培养基（所有血清型 AAV）第五天：转染 72h 收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用 PEG8000 沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。病毒纯化浓缩将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。病毒滴度检验1)腺性相关病毒处理破除 AAV 病毒外壳，37 ℃孵育 30 min，然后加热 95 ℃5 min 使酶失活，体系如下：组成成分 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 体积病毒液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5ul蛋白酶 K（5ug/ul） ? ?1ul超纯水 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4ul2)离心 12000rpm,2min.取上清。3)标准品的拷贝数，7 个梯度稀释浓度分别：7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V.G./UL,7.2