环境与生命学院化学分析技术实验教学手册.doc

環境與生命學院化學分析技術 實驗教學手冊 儀器名稱: 高效能液相層析儀 組別:第三組 組員:梁弘憲4CM1010031(組長) 方鈺評4CM1010012 徐珮慈4CM1010009 麥浩儀4CM1010053 翁健鈞4CM1010035 指導教授:王昭凱 (老師) 前言: 高效能液相層析技術 (High Performance Liquid Chromatography HPLC) 為分析技術中應用最廣泛的一種分離方法，可用於定性與定量分 析樣品中的有機物質。是製藥、食品、美容等工業常用的品管儀器。 貳、實驗目的: 1. 了解高效能液相分析儀分析之原理。 2. 學習到如何操作使用高效能液相層析儀，並且熟悉儀器之操作使用。 3. 了解糖精與胺基酸之分析方法。 4. 應用液相層析之原理計算分析樣品之濃度與性質。 5. 熟練高效能液相層析儀之操作過程，以及實驗過程所有安全事項。 參、儀器構造: 肆、實驗原理: 層析系統最為重要的兩組成為:一、固定相 (stationary phase)- 分離管柱;二、流動相 (mobile phase) -溶劑。 層析分離過程，主要由不同物質，在兩個不相溶的媒介 (亦即固定 相及流動相 ) 之間的平衡分佈差異而定。欲分離的成份需先溶於溶劑 中，然後在高壓下注入分離管柱，樣品中的各個成份藉由移動相的帶 動，滲透通過分離管柱中的固定相。各成份的移度依其平衡分佈狀態而 定，有些成份和固定相之間的作用力不大，很快地被沖堤出分離管柱， 而有些成份與固定相作用力較快，則較慢沖堤出來。也可說明為此兩者各有不同之極性或非極性強度;樣品分子因本身 極性之強弱，與此兩相 ( 固定相、流動相 ) 親和力不為相同，與固定 相親和力大者，較易停留滯原地;與流動相親和力大者，較易隨流動相 移動，就是因為如此，才達到分離之目的。實驗技術中以分離柱效率與 溶劑之效率為關鍵指標 分離柱效率 實驗時要先考慮液體通過管柱時偵測圖之尖鋒寬度程度，再來決定 分離柱之設計以及操作條件。分離柱之效率可以使用理論板數 (N) 或 者理論板等值高度 (EETP) 來為定量說明。就一般來說，分離柱親合樣 品量與流出樣品量應相等，如此一來分離效果最佳。如要比較不同分離 柱效率或者是不同條件時，可用 HETP 值作為比較。 (L) 是分離柱之 長度， N 值數目越多 HETP 值越小???效率則越高。 理論板數 (N) 之定義如下表 : 二、溶劑之效率 溶劑效率來自於溶質以及溶劑之間的作用力，決定試料中各種成分 在圖譜中的相對位置，而且可以因為作用力的不同而觀察到混合物分離 之現象。 伍、實驗器材及樣品: 1. 高效液相層析儀( 需含電腦一台與印表機 ) 。 2. 4 位數精密天枰。 3. 1000 毫升燒杯、 1000 毫升量瓶、稱量紙。 4. 氣泡去除閥。 5. Sacchanin( 糖精 ) 。 6. 胺基酸。 7. 正乙院 (n-Hexane) 。 8. 異丙醇 (Isopropyl alcohol) 。 9. 甲醇。 藥品 MSDS 請參閱附件二。 陸、實驗步驟: 一、樣品配置: 1. 取胺基酸 lO mg 溶於 l00 ml 的甲醇中，約為 l00 ppm。 2. 取胺基酸 2.3 mg 溶於 3 ml 的異丙醇中，約為 766.7 ppm。 3. 取糖精 2.5 mg 溶於 4 ml 的異丙醇中，約為 625 ppm。 4. 胺基酸衍生化，先取 0.O0l mol 的三聚氯化物加入溶液中，攪拌 1 小時後加入 HCl 直到大量沉澱，過濾並用大量純水沖洗，將濾餅乾燥，取 2.5mg 的胺基酸衍生 物溶於 1O ml 水中(如胺基酸衍生物不易溶解，可用微量的碳酸鈉調整 pH 值約為 8.0)約為 25O ppm。 二、儀器操作步驟 : 13.點選監測鈕後會跳出選擇參數畫面，參數通常不變的。(在這的參數指的是環境參數) 19.當關閉幫浦後就可以關閉視窗 20.關閉 HPLC 軟體。 21.關閉 HPLC 介面連結器電源。 22.關閉幫浦電源。 23.關閉偵測器電源。 24.關閉電腦主機、螢幕及印表機電源。 三、維護保養與注意事項: 1、切勿分析高分子物質以免管柱阻塞。 2、每周以流動相清潔分離管柱與管路一次。 3、每季檢查分離管柱的效能。 4、每年檢查幫浦與偵測器的效能。 柒.實驗結果: 樣品:各式蜜餞 (第一次) (第二次) 捌、實驗討論: 本次實驗的重要及注意事項 幫浦壓力不足，使儀器程式要重新開啟。 實驗完成後，儀器勿馬上關閉，要等30分鐘後使其運轉完畢，而後再按步驟關機。 糖分會在前15分跑出數據。