实验三酵母核糖核酸的提取及测定实验报告.docx

PAGE \* MERGEFORMAT6 生物化学实验报告 实验三 酵母核糖核酸的提取及测定 一、研究背景及目的 RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有着重要作用。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。核糖核苷酸与其衍生物作为一大类RNA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。[1]可见，无论是科研工作还是商业产品的生产过程，都需要大量的纯品RNA作为原料。但是RNA的活化能较高，不易直接合成，而天然材料中的RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，故采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA就显得至关重要。目前，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。 本实验中，我们需要了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路，掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节，并以酵母为材料学习RNA提取和测定的基本操作方法。 二、原理 1.选材 即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料的易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料，本实验中我们以食品用干酵母粉直接作为RNA提取的原料。 2.提取 此处需要明确科研与工业生产的差异。科研工作??，通常需要得到有活性的RNA分子，以研究其生物学功能，故在提取过程中需要保证一级结构不被破坏，而后通过一定的手段使其恢复到正确的空间结构。所以在提取过程中动作要轻柔，避免机械力（如气泡破裂等）打断RNA链，另外，提取时较多的使用了有机溶剂。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。此外实验室所广泛使用的RNA试剂盒使方便、快速提取纯度高、完整性好的RNA分子实现了可能。 然而在大工业生产中，要求降低成本，只需获得纯品核苷酸，没有必要保证RNA链的完整性，且方法需要适合机械化生产的流水线，因此工业制备RNA常采用浓盐法和稀碱法，用这两种方法所提取的均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。两种方法的原理不同，浓盐法是原理是即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中；稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解，释放RNA。本实验中，我们使用浓盐法提取RNA。[3] 3.分离与纯化 在提取时我们使用了沸水浴，这不仅使细胞破碎，RNA释放，同时让相当多的一部分蛋白质变性，疏水氨基酸暴露，溶解性下降，生成沉淀。经过冰浴冷却，温度骤降，热变性蛋白发生错误折叠形成足够稳定的构象而并非原来的空间结构。这样，离心之后，母体残渣和热变性蛋白与溶解在上清液中RNA得以分离。随后，根据核酸的两性特点，采用等电沉淀法，调节体系pH 2.0，使RNA以沉淀形式析出。在分离RNA的同时，也除去了一部分DNA和蛋白质等杂质。最后，利用95%的乙醇洗涤RNA沉淀，由于RNA不溶于乙醇，而其他脂溶性物质溶于乙醇，这样就除去了少量的其他脂溶性杂质。 4.含量测定 测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法，定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。三种方法各有特点，但考虑到学生实验的操作时间、安全性及实验器材等可行性因素，我们在本次实验中用比消光系数法（以紫外法为基础）测定RNA的OD260值，计算溶液中的RNA含量，最终得出制品纯度和RNA提取率。 三、仪器与试剂 仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、FA1004电子分