圖解RCR的反应原理类型应用范例.pptVIP

生物化学实验技术;目 录; 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction);体内DNA的复制体系;Mullis的PCR构思;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);PCR反应循环; PCR的指数扩增（2n）;;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP（10mM or 2.5mM ） 含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 30-60秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加; PCR的应用 1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离或制备。 A、DNA B、cDNA 2、基因表达分析（原位、离体） A、基因是否表达 B、基因表达水平高低 3、基因突变;基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）; 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物;荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达水平 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 ;;反向PCR (reverse PCR) 扩增已知序列两侧的未知序列;; 实时荧光定量PCR仪;1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆载体 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2;1.反应体系（50μl体系）： 10 X PCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 10μmol/L引物2 模板DNA TaqE 补充水 ;2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： ;3.PCR扩增程序： 94℃ 5-10min（预变性） 94 ℃ 30S 55 ℃ 30S 72℃ 30S 72℃ 5-10min（后延伸） 4 ℃ 保温 ;屏幕显示方式;Main　 Run Enter List Edit File Lid;Enter;;Step #1Option？ No yes;不需要拓展功能;Segment #4H