實验二细胞培养的基本知识和准备.pptVIP

实验二、 细胞培养的基本知识和准备;为什么要进行细胞培养;细胞培养的优点;第一部分.细胞培养的基本知识;（一）培养细胞的类型及其特点;（1）贴附型;体外培养贴附型细胞形态;成纤维细胞;培养细胞的类型及其特点;2、上皮样细胞：细胞多呈扁平三角形或不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。皮肤表皮以及消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 ;上皮样细胞;3、游走样细胞：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。;(2) 悬浮型;;培养细胞的生长和增殖过程;1．原代培养期 原代培养也称初代培养，是从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。一般持续1-4周。; 2．传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。 ;3．衰退期 处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。 以上主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性（immortality）或恶型性malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line ;培养细胞一代的增殖过程;潜伏期（Latent Phase）：; 初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10???30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。 细胞接种密度大时潜伏期短。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。;另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。;潜伏期 1.悬浮期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时 ;2. 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） ;;潜伏期 待细胞贴附于支持物后，细胞便开始进一步伸展成极性细胞，但这距离细胞进入生长和增殖期还有一定时间，称为潜伏期（latent phase）。此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。;; 过程: 游离期: 悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附期:贴附底物,一般24小时内贴壁 潜伏期:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相;原因:;影响因素：; 1.细胞密度 接种分散细胞,接种的密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长 2.细胞类型 传代培养的细胞之潜伏期比原代培养的细胞短。 传代培养期的细胞,一般为6-24h;原代24-96h或更长。单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢 连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短 来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长 成体:长; 3.细胞机能状态 不良者慢 4.培养条件 培养液, pH, 底物 不利:污染,有毒;对数生长期： 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多，便标志着潜伏期的结束和对数生长期（logarithmi