食品中菌落总数的测定方法.doc

食品微生物学检验 菌落总数测定 1范围 本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。 本标准适于食品中菌落总数的测定方法。 2术语和定义 菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等),所得1mL(g)检样中所含菌落的总数 3设备和材料 恒温培养箱：36±1℃ 30±1℃； 冰箱：2～5℃； 恒温水浴：46±1℃； 天平：感量为0.1g； 均质器；? 震荡器； 无菌吸管1mL、10mL或微量移液器及吸头； 无菌锥形瓶：250 mL；500 mL； 无菌培养皿：直径90mm；? pH计或pH比色管或精密pH试纸； 放大镜、菌落计数器 4培养基和试剂 4.1平板计数琼脂培养基 4.1.1成分 胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.0±0.24.1.2制法 将上述成分加入到蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管和锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2磷酸盐缓冲液 4.2.1成分 磷酸二氢钾KH2PO434.0g蒸馏水500mLpH7.24.2.2制法 贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。 4.3无菌生理盐水 4.3.1成分 氯化钠8.5g蒸馏水1000mL4.3.2 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，，121℃高压灭菌15min。 5检验程序菌落总数的检验程序如下： 检样 25g（或25mL）样品+225mL稀释液，均质 ↓ 10倍系列稀释 ↓ 选择2～3个适宜样品匀液， 各取1mL分别加入无菌培养皿内 ↓ 每皿中加入15 ～ 20mL 平板计数琼脂培养基，混匀 ↓ 培养 36℃±1℃↓48 h±2 h 计算各平板菌落数 ↓ 计算菌落总数 ↓ 报告 6操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min～10 000r/min 均质1 min～2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min ，制成1：10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。 6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1： 10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.4 按3.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL无菌吸管或吸头。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。 6.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃ 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃ 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6.2 培养 6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃ 培养48h±2h 。水产品30 ℃±1 ℃ 培养72h±3h. 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。 6.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。 6.3.1 选取菌落数在30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则