分子信标 纳米生物传感器.pptVIP

纳米生物传感器—分子信标; 分子信标作为具有高灵敏度和选择性的核酸探针，能方便的运用于核酸与蛋白质的研究，能够为生物大分子的功能和作用机理的研究提供丰富的实时信息，成为一种极具发展潜力的新型核酸探针。分子信标是Tyagi 和Kramer在1996年首次合成的，它的设计非常巧妙。分子信标将核酸的序列结构信息转变为荧光信号，具有很高的灵敏度与选择性。 分子信标是一段呈发夹结构的合成的短链DNA，其环状部分是一段含有20个左右碱基的与目标核酸互补的核酸序列，发夹的两臂是序列互补的5～8个碱基对并在两端分别固定有荧光基团和荧光熄灭基团。基于荧光共振能量转移原理，分子信标类似于一个开关，当荧光基团和熄灭集团靠得很近时不发荧光，即处于关闭状态。但是当分子信标与互补的DNA发生相互作用时，由于分子间的相互作用力使发夹状的结构打开，此时就能观察到较强的荧光，即处于开启状态。 ;;;2. 信标柄部 是指信标分子两端长度为5-8个碱基相互互补的部分，往往由GC含量较高的碱基组成以提高结合能力并减少长度。柄部结合能的选择要与分子信标和目标核酸杂交结合能相匹配。柄部的存在使信标分子的杂交特异性明显高于相应的线性探针。 3.荧光基团和荧光熄灭基团以及连接臂 最常用的荧光熄灭基团二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）基， 采用DABSYL作猝灭剂是由于它对多种荧光素都有很强的荧光猝灭效率。荧光剂和猝灭剂与核苷酸的连接要引入长度为7-9个原子的连接臂。;分子信标的性质 在室温处于自由状态时分子信标的荧光信号微弱，随着溶液温度升高荧光逐渐增强，说明分子信标的柄部受温度影响而打开了。分子信标的熔点温度取决于柄部长度、柄部中GC 含量以及溶液中盐的浓度。二价阳离子尤其是Mg2+对分子信标的柄部杂交有稳定作用。例如， 13bp的柄部，在Mg2+不存在时熔点为27?C，而在1mmol/L MgCl2为56 ?C 。5-8 13bp的柄部，在Mg2+不存在时不能形成稳定的杂交物，而在1mmol/L MgCl2中形成稳定的发夹结构，所以分子信标杂交实验均在含有MgCl2的缓冲溶液中进行。 ;优点;;FIG. 3. Phase transitions of molecular beacons. When annealed, the molecular beacon–target hybrid is fluorescent. As the temperature is raised, the fluorescent probe–target hybrid denatures and a nonfluorescent molecular beacon in a closed formation is formed. On further rise in temperature, the hairpin stem denatures and the molecular beacon forms a fluorescent random coil. ;Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells ;;(A and C) Fluorescence signal of single random sequence molecular beacons in (A) normally-growing and (C) stimulated HDF cells, respectively, representing the background due to beacon degradation and non-specific interactions. (B and D) Fluorescence signal due to single K-ras targeting donor beacons in (B) normally growing and (D) stimulated HDF cells under Cy3 excitation (545 nm) and emission detection (570 nm). ;(E) normally growing and (G) stimulated HDF cells, respectively, under Cy3 excitation (545 nm) and FRET detection (665 nm), representing the background in dual FRET beacon assays. (F and