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曾慧慧部分 氧化还原体系及其抗氧化评价方法和技术 （一）背景知识 1.现代生物技术的核心技术：生物大分子的分离、检测、制备和改造技术 2.生物体内氧化还原系统： NADH/FADH2系统、谷胱甘肽过氧化酶系统、硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶系统 3.氧化性损伤及相关疾病 ①脂质氧化性损伤：病毒、细菌毒素、动物毒素损伤；膜流动性（微环境）改变、膜穿孔及破损 痛风病、脑缺氧、缺血损伤、癌细胞 膜损伤标志：膜流动性下降（饱和脂肪酸多，流动性下降；过氧化产物MDA交链，流动性下降） 膜损伤是某些疾病的早期标志 膜流动性评价：直接法：粘度变化测定、自旋标记法 间接法：RBC膜丙二醛（MDA）含量测定 ②脂蛋白氧化性损伤： 脂蛋白及其分类：电泳法：乳糜微粒（CM）、前β-脂蛋白（VLDL）、β-脂蛋白(LDL、IDL)、α-脂蛋白（HDL） 超速离心法：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白 脂蛋白构成：CM主要转运TG、TC，诱发胰腺炎；VLDL主要转运内源性TG（一半以上），冠心病；IDLTC上升，动粥；LDL主要内源性TC，动粥；Lp（a）类似于LDL，动粥独立因素或冠心病；HDL主要逆向转运TC，抗LDL氧化 LDL氧化性修饰和心血管病… 脂蛋白分离方法：电泳法、超速离心法 ③DNA氧化性损伤：肿瘤 损伤因素：Ca离子、脂质过氧化、羟自由基、光照、氧应激 （二）生化分离技术 1.生化分离技术内容： ①生物组织与细胞的破碎 ②提取/萃取和沉淀分离技术 ③过滤与膜分离技术 ④层析分离技术 ⑤离心分离技术 ⑥电泳分离技术 生物原料的选择和预处理 注意有效成分的含量，包括品种选择、器官选择和生长期选择等 保存生物材料的方法包括速冻和有机脱水等 纯化前预处理：除去结缔组织哪个非活性部分；-20℃保存；有机溶剂去水以延长保存时间；植物叶片洗净、种子泡胀或粉碎等 2.生物组织与细胞破碎 组织破碎：磨切法：匀浆法/高速组织捣碎机 细胞破碎的需要：制备生物膜制剂、胞内物质的获取 细胞破碎方法：原则：不影响酶活性 ①机械破碎法：研磨法：较温和，适宜实验室使用。研钵和研棒或匀浆器，可加石英砂 组织捣碎器法：保持低温，时间不宜太长。捣碎器，可加石英砂；组织匀浆器 压力匀浆法和冻融法：用于破碎培养细胞株和淋巴细胞 ②物理破碎法：温度差破碎法：置低温冰冻，取出迅速融化，反复多次 压力差破碎法：气穴作用，高压释放，用于破碎培养细胞株和淋巴细胞 超声波破碎法：注意温度和时间，多用于微生物细胞 ③化学破碎法：常用试剂：甲苯、丙酮、氯仿等脂溶性有机溶剂或Triton、Tween等非离子表面活性剂 原理：脂溶性溶剂或表面活性剂将细胞壁细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎。低温进行防止酶变性失活 ④酶促破碎法：自溶法：利用细胞本身酶系，取决于温度、pH值和离子强度。需加少量防腐剂 外加酶：降解细菌细胞壁随之因渗透压差引起细胞膜破裂（注意点：低渗或等渗介质中进行，减少细胞器损伤） 3.提取 利用一种溶剂对不同物质溶解度差异，从混合物中分离一种或几种组分的过程称为提取/萃取或抽提 抽提液条件：对有效成分溶解度大，破坏作用晓；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全。 影响因子（影响溶解度的因素）：离子强度（盐溶盐析）、PH值（偏离等电点）、温度（0-10℃）、去垢剂（中性去垢剂）、变性剂（SDS、尿素：溶解剂；TCA、PCA：沉淀剂） 提取方法：固液萃取：提高破碎程度、进行搅拌、延长时间、提高温度、减少粘度 液液萃取：二相溶剂 保护措施：采用缓冲体系：Tris缓冲、磷酸缓冲体系等 添加保护剂：添加某些还原剂，如巯基试剂及二硫丁醇类化合物；金属螯合剂，如EDTA 抑制水解酶：EDTA-抑制水解酶Dnase（金属离子激活）；热提法；调节pH；加入抑制剂 （SDS、蛋白酶K-提取RNA时；甲基磺酰氟化物、碘乙酸-提取蛋白酶时） 4.分离纯化 粗分离：沉淀、离心分离 纯化：层析、电泳 分离纯化技术：膜分离技术（过滤/透析/电渗析，按分子大小）、层析法（极性）、电泳法（电性）、离心技术（分子大小） 纯化方法选择：1低分辨力到高分辨力（萃取沉淀吸附等）2采取高分辨力方法 层析技术 吸附层析：利用吸附层析介质表面的活性基团或活性分子对流动相不同组分吸附性能差异进行分离的方法 分配层