表達产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定.pptVIP

外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率;相关帮助;;在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。 酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。 几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。 由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗??等。;微观的酵母细胞;5AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3 AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。;pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点;1. 载体的3 AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组;甲醇酵母系统高效表达影响因素;外源基因的3末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。;模型构建原理;我们将40例数据按75％的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数，如此重复1,000次，这样我们得到了1,000个判别函数，如第一个判别函数为： HEG1=－20.20203＋0.52552X1－2.35843X2＋1.53122X3－2.24870X4－1.19898X5＋1.53908X6 (1) LEG1=－14.37028＋0.00749X1－0.04135X2－0.87256X3＋2.02204X4＋0.15215X5 －0.74495X6 (2) 这里的X1, X2, X3, X4, X5 和X6分别代表区间[18,123]，[31,140]，[35,150]，[90,118]，[90,151]和[95,135]的用RNAfold软件计算的最低自由能（计算温度参数设为30℃）。 对于每个新数据，为了预测该基因是否能在酵母中高效表达（表达水平大于100 mg/L），可先计算这6个区间的最低自由能，然后运算上述的1,000个判别函数，来评估该基因高效表达的概率。如果在这1,000次的判别分析中，有500次或以上的HEG1大于LEG1，那么这个外源基因为一个表达水平大于100 mg/L的基因，否则就是个表达水平低于100 mg/L的基因。 ;外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器;分析流程： 在“sequence”方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体100bp组成的200bp序列片段； 点击底下的“Evaluation”按钮，在“Evaluation”方框中显示预测的结果； 如果结果显示低于0.5，则可点击“Design”这个按钮，则显示根据密码子使用改造后的序列。;用该软件来预测NGAL在毕赤酵母高效表达的概率;学习SDS测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法 了解蛋白印迹技术原理和方法;带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。; 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N,N,N?,N?-四甲基乙二胺(N,N,N?,N?-tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium