第七章 分子标记.pptVIP

第七章 分子标记技术;什么是遗传标记？;遗传标记的类型;形态学标记;细胞遗传标记;生化标记;材料的采集;同工酶与等位酶;在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。 例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。 又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源、分类等。 动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。 细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比较来确定。 在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。 ;分子标记;分子标记的三个阶段;目前的分子标记类型;1、RFLP;限制性内切酶识别DNA中特殊的核苷酸序列;不同个体中的酶切位点不同，所以，种群具有限制性片段多态性。;用特异性的 限制性内切酶 进行酶切， 得到不同长度 的DNA片段， 这些片段在 跑电泳中 会分离。 ;限制性片段长度 多态性 通常被人们用来 标记目的基因。;特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。;2、RAPD; RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段。 一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。;RAPD;RAPD;RAPD;Template DNA;M;3、AFLP;首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。 ;技术路线;AFLP结合了RFLP与PCR技术的特点，兼具RFLP和RAPD两种方法的特长，既继承了RFLP的稳定性，又具有了PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点。采用少数几对引物的多种组合即可获得大量遗传信息，避免了RAPD分子标记重复性差、假阳性反应过高等不利因素的影响，同时又无需任何目的基因组DNA的背景资料即可完成模板DNA多态性检测，摆脱了RFLP的转膜、克隆、探针制备、分子杂交等一系列繁重且又有一定难度的工作 。;用AFLP分析的多态性是典型的孟德尔式遗传和选择中性。它可以用于遗传分析的各个方面：如用于拟南芥属连锁图的构建用于马铃薯的栽培种的鉴定等。AFLP也适于鉴定遗传多样性的物种亲缘关系的研究 。; （1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。 ; 专利技术，试剂盒价格贵 需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备 基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。 ;应用;第二代分子标记;三）简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）; 由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列